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Konfokale Raman Mikrospektroskopie mit einem Mausklick

Die Raman-Mikroskopie hat sich in der neueren Vergangenheit als eine leistungsfähige spektroskopische Meßmethode für die schnelle und zerstörungsfreie Analyse einer breiten Palette von Proben erwiesen. Die Raman-Mikroskopie ergänzt nicht nur die komplimentäre schwingungs-spektroskopische Methode der IR-Mikroskopie. Darüber hinaus ist die Raman-Mikroskopie die Methode der Wahl, wenn es beispielsweise um die berührungs- und zerstörungsfreie Molekül-spektroskopische Analyse von Einschlüssen in Werkstücken oder Mineralien geht.


In der Regel ist es interessant, die Probenoberfläche flächendeckend spektroskopisch zu charakterisieren. Die OPUS-Softtware bietet hierzu eine Reihe von Möglichkeiten, die alle auf dem schnellen „chemischen Mapping“ d. h. der spektroskopischen Erfassung des interessierenden Probenareals basieren. Die Auswertung und Visualisierung der chemischen Mappings reicht von der „Classical single value“-Integration bzw. Peakhöhenbestimmung von einzelnen Raman-Linien oder Spektralbereichen bis hin zu chemometrischen Auswerteverfahen wie etwa der 3D PCA (Principal Component Analysis).

Für eine Reihe von Anwendungen kann es jedoch erforderlich sein, nicht nur in xy-Richtung zu analysieren sondern zusätzlich in z-Richtung. Die konfokale Raman-Mikroskopie bietet ideale Voraussetzungen für eine bestmögliche axiale (z-Achse) räumliche Auflösung bei der Tiefenprofilierung von Proben.

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Abb 1a zeigt die typische Anordnung einer Mikroskop-Optik. Der einfallende Laserstrahl wird mit dem Mikroskop-Objektiv auf den interessierenden Probenbreich fokussiert (Fokuspunkt in der Probenebene hier nicht gezeigt). Zusätzlich zur auftretenden Streustrahlung im Probenfokus entsteht unterhalb und oberhalb der Probenebene Streustrahlung (dargestellt als Z1 [rot] und Z2 [blau]). Wenn beide Punkte Z1 und Z2 innerhalb des Erfassungsvolumens, definiert durch die Tiefenschärfe des Mikroskop-Objektivs liegen, dann wird das resultierende Raman-Spektrum Beiträge aus den Bereichen Z1 und Z2 enthalten.

Eine konfokale Anordnung würde dagegen das Probenvolumen reduzieren und zu einer Unterscheidung von eventuellen spektroskopischen Unterschieden zwischen Z1 und Z2 führen.

Das Prinzip der konfokalen optischen Mikroskopie zeigt Abbildung 1b. Bei dieser Konfiguration wird eine konfokale Apertur in eine separate Bildebene platziert mit dem Ziel, die Tiefenschärfe der Abbildung zu verbessern. In diesem einfachen Beispiel wird das von Punkt Z2 gestreute Licht durch den Einsatz der Aperturblende blockiert. Dagegen wird das gestreute Licht des Punktes Z1 auf den Detektor abgebildet. Auschließlich die axial und im Fokus liegenden Strahlen werden in einem konfokalen System durch den Spektrographen registriert. Das Ergebnis ist, dass konfokale optische wie auch Raman-Mikroskope das Probenvolumen signifikant gegenüber konventioneller Optik verringern. Zusätzlich werden durch konfokale Messungen Verbesserungen bei der Unterdrückung von Streulicht und unerwünschter Fluoreszenz erzielt. Nicht alle konfokalen Mikroskopen sind in derselben Weise konstruiert. Traditionell wird für konfokale Raman-Mikroskope, wie in Abbildung 1b gezeigt, eine am Eingang des Spektrographen positionierte Lochblende verwendet. Das Raman-Streulicht wird auf die Lochblende fokussiert und der divergierende Strahle hinter der Lochblende wird refokussiert auf den Eintrittsspalt des Spektrographen. Unterschiedlich große Lochblenden werden zur Kontrolle der Konfokalität eingesetzt während der Eintrittsspalt für die Einstellung der spektralen Auflösung verwendet wird. Ohne Zweifel bietet diese Anordnung eine unabhängige Kontrolle von Konfokalität und spektraler Auflösung. Andererseits führt die getrennte Anordnung beider Blenden zu Problemen bei der Justierung und Beibehaltung des optimalen  Durchsatzes. Der Grund hierzu liegt in der doppelten Fokussierung des Strahls durch zwei von einander abhängigen, sehr kleinen Blenden. In der Praxis bietet daher die unabhängige Kontrolle der beiden Aperturen wenig Vorteil.


Typische Schlitzbreiten müssen kleiner als 100 µm sein, um eine akzeptable spektrale Auflösung zu erreichen und größer als 25µm sein um Beugungseffekte zu vermeiden. Die Größe der Lochblende sollte größer als die Beugungsgrenze sein. Zu große Lochblenden sind jedoch für konfokale Messungen unzweckmäßig. Weiterhin machte es wenig Sinn die die Schlitzweite für die Kontrolle der spektralen Auflösung größer als die konfokale Lochblende zu machen, weil es den Signaldurchsatz nicht erhöht (unter der Voraussetzung einer 1:1 Abbildung). Daher wird in der Regel der Durchmesser von Schlitzblende und Lochblende gleich gehalten, sodass eine Redundanz gegeben ist. Wie in Abbildung 2a gezeigt, kann man die räumliche Auflösung durch die Kontrolle des Eintrittsspaltes in einer Richtung und die spektrale Auflösung des CCD-Detektors durch die Kontrolle des Eintrittsspaltes in der dazu senkrechten Richtung durchführen. Die Effizienz dieser Konfiguration hängt von der Abbildungsqualität des Spektrographen ab; z.B. sollte eine Punktförmige Quelle am Eintrittsspalt entsprechend d. h. ohne Verzerrungen auf der CCD abgebildet werden. In der Realität führt die nicht-ideale Abbildungsleistung des Spektrographen dazu, dass die sogenannte „pseudo-konfokale“ Lösung (Abb. 2a) in Punkto räumlicher Auflösung unterlegen ist. Durch die reduzierte Anzahl an optischen Bauteilen bietet die „pseudo-konfokale“ Abbildung eine höheren Strahlungsdurchsatz als das die konventionelle konfokale Anordnung, jedoch vergleichsweise wenig Durchsatz im Vergleich zu einer nicht-konfokalen oder sogar „High-Throughput“-Lösung.

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Bei Bruker Optics wurde eine neue Methode entwickelt, die die erforderliche Flexibilität für Raman-Mikroskopanalysen ohne Kompromisse bietet.
FlexFocus benutzt eine Hybrid-Aperture die aus einem Array von hochpräzisen Loch- und Schlitzblenden besteht. Per Mausklick können so, wie in den Abbildungen 2a und 2b gezeigt, entweder konfokale oder Messungen mit hohem Durchsatz erfolgen. Wenn die Schlitzblende angewählt ist werden Spektren mit hoher Signalstärke und hoher lateraler Auflösung erzeugt jedoch ohne Konfokalität in Z-Richtung. Bei Auswahl einer Lochblende werden Spektren in hoher konfokaler Auflösung erzielt.

Im konfokalen Modus ist der Durchsatz vergleichsweise begrenzt. Daher ist es von Interesse, in einem Raman-Mikroskop-System beide Möglichkeiten hoher Durchsatz und/oder konfokale Messung auf Mausklick gemäß Abb. 2a und 2b zur Verfügung zu haben. FlexFocus vermeidet auf der einen Seite den recht mühseligen Gebrauch der traditionellen konfokalen Anordnung aber auch den Kompromiss der pseudo-konfokalen Lösung mit nicht akzeptabler Tiefenauflösung. FlexFocus ermöglicht Hochdurchsatz-Messungen mit hohem Signal-zu-Rausch-Verhältnis für schnelle Datenaufnahme oder alternativ optimale konfokale  Leistungsfähigkeit, wenn erforderlich. Mit einem 100x-Objektiv und 50 µm Lochblende ist eine Tiefenauflösung von besser als 2 µm erreichbar

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US 6141095; US 7102746