N C

Secuenciación de N-terminal y C-terminal

Caracterización descendente por MALDI

Identificación de proteínas mediante medición de la masa intacta y confirmación de modificaciones en los extremos N-terminal y C-terminal, como truncamientos y mutaciones sin proteólisis en menos de un minuto con la secuenciación de proteína intacta por MALDI.

La medición de masa intacta de sus tratamientos (anticuerpos inclusive) es posible gracias a los instrumentos MALDI-TOF de Bruker, debido al amplio rango de masas que les permite el detector Flash patentado.
La secuenciación descendente o top-down (TDS) amplía considerablemente las posibilidades de los espectrómetros de masas Bruker. La TDS permite el acceso directo a la información de la secuencia incluso de proteínas de gran tamaño sin digerir. Detecta y localiza las modificaciones químicas, modificaciones postraduccionales, mutaciones e isoformas de proteínas, que son más difíciles de detectar mediante las digestiones con tripsina clásicas. La TDS también ofrece la posibilidad de caracterizar los extremos de las proteínas de forma selectiva y amplía considerablemente las capacidades previstas con antelación de la degradación de Edman.
Un elemento que todos los métodos TDS tienen en común es el uso de técnicas de fragmentación que generan la rotura de enlaces peptídicos directamente en el punto de excitación de la secuencia de péptidos. Esto proporciona escaleras regulares relativamente sencillas de interpretar.

NIST LC ISD ST

Secuenciación de extremos de proteínas N-terminal y C-terminal

La técnica por MALDI-TDS lee con eficiencia las secuencias de los extremos N-terminal y C-terminal de las proteínas de mayor tamaño (> 40 kDa) mediante la degradación por fragmentación en la fuente de iones (ISD) de la espectrometría de masas por desorción/ionización (MALDI). La MALDI-ISD genera especies de carga única, lo que facilita considerablemente la lectura de la secuencia. Esto se puede utilizar para identificar una proteína desconocida y para asignar estructuras detalladas a las proteínas de unión o puntos de mutación. Hasta proteínas y anticuerpos PEGilados complejos para tratamientos (por masa intacta o subunidades) se pueden analizar por MALDI-TDS. Como complemento y valor añadido de las capacidades de secuenciación tradicionales de la degradación de Edman, la técnica MALDI-TDS funciona también en proteínas con bloqueo en su extremo N-terminal y proporciona además información sobre el extremo C-terminal. Por otra parte, solo se tardan unos minutos en completar el método, desde la preparación de la muestra, la adquisición del espectro y el procesamiento de espectros mediante el rápido y fiable software TDS hasta el resultado en forma de espectro ISD comentado. Se puede generar automáticamente un informe en formato PDF para aportar un resultado documentado del análisis.

En resumen, las ventajas de MALDI-TDS comprenden:

  • La generación de información de la secuencia, incluso de proteínas de gran tamaño sin digerir.
  • La rápida caracterización de los extremos N-terminal y C-terminal.
  • Valor añadido para la degradación de Edman.

 

 

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«Secuenciación descendente (top-down) de proteínas en un minuto»