SENTERRA II head

FlexFocus: Spectroscopie Raman confocale à la demande

La microscopie Raman est devenue une technique privilégiée pour l’analyse rapide et non destructive d’échantillons de faible dimension. La microscopie Raman complète et étend les possibilités d’analyse en microscopie infrarouge. Alors que la microscopie infrarouge conventionnelle est limitée à des dimensions d’échantillon d’au moins plusieurs microns, la microscopie Raman peut mesurer en routine des échantillons aussi petits qu’un micron.


Pour certaines applications, la possibilité de mesurer le profil de l’intérieur d’un échantillon peut aussi être importante. La microscopie Raman confocale offre la possibilité unique d’analyser un échantillon selon l’axe Z. La microscopie confocale est un arrangement optique qui améliore la résolution spatiale axiale (axe Z) pour réaliser un profil en profondeur de l’échantillon.


Un exemple typique de microscopie optique conventionnelle est présenté dans l’illustration 1(a). La radiation laser incidente est focalisée avec l’objectif du microscope sur la zone d’intérêt de l’échantillon (non représenté). La lumière laser est diffusée depuis deux profondeurs de l’échantillon représentées comme Z1 (rouge) et Z2 (bleu). Si les deux points sont dans le volume de collection défini par la profondeur de champ définie par l’objectif et l’optique du système, le spectre résultant sera une moyenne des spectres des points Z1 et Z2.


Un design optique confocal peut être utilisé pour réduire le volume d’échantillonnage et améliorer la résolution spatiale afin de mieux discriminer les différences spectrales potentielles entre Z1 et Z2.

 

Conventional confocal microscope optics

Le principe de la microscopie confocale optique est présenté sur l’illustration 1(b). Dans cette configuration, une ouverture confocale est placée dans le plan image conjugué pour réduire la profondeur de champ d’échantillonnage.

Dans cet exemple, l’ouverture bloque la lumière Raman diffusée depuis Z2, ce qui permet d’obtenir un spectre relatif uniquement à Z1. Seules les raies de lumières dans le plan focal et dans l’axe sont enregistrées par le spectrographe car l’ouverture confocale bloque les raies de lumière hors focus et hors axe. Le résultat est que l’optique confocale et les microscopes Raman restreignent la profondeur d’échantillonnage à une région qui est plus petite que celle obtenue en utilisant des optiques conventionnelles.


De plus, les mesures confocales peuvent améliorer la réjection de lumière parasite et réduire la fluorescence. Les microscopes Raman confocaux n’ont pas tous le même design. Les microscopes Raman confocaux traditionnels, comme illustré schématiquement en 1(b), utilisent une ouverture trou d’épingle placée devant la fente d’entrée du spectrographe. La lumière Raman est focalisée au niveau du trou d’épingle et le faisceau divergent après le trou est ensuite refocalisé dans la fente d’entrée du spectrographe. Différentes ouvertures peuvent être utilisées pour contrôler le degré de confocalité, pendant que la fente d’entrée est utilisée pour contrôler la résolution spectrale du spectromètre.Alors que la configuration confocale vraie fournit un contrôle indépendant des résolutions spectrales et spatiales, elle est très difficile à aligner et à maintenir pour une performance optimale. Ceci est dû au fait que le faisceau est focalisé deux fois à travers de très petites ouvertures. En pratique, le contrôle indépendant des ouvertures apporte peu. Les largeurs de fente typiques doivent être inférieures à 100 µm pour obtenir une résolution spectrale acceptable et supérieures à 25 µm pour éviter les effets de diffraction. La dimension des trous d’épingle doivent être supérieures à la limite de diffraction mais pas trop grandes non plus si on veut conserver leur intérêt. De plus utiliser des fentes plus larges que le diamètre des trous n’améliore pas l’intensité du signal (sur la base d’image parfaite 1 :1 entre le trou et la fente). C’est pourquoi la plupart du temps le diamètre du trou et la largeur de la fente sont de même dimensions, les rendant ainsi redondants. 

Comme illustré en 2(a), la résolution spatiale peut être contrôlée par une combinaison d’une fente d’entrée dans une direction, et la résolution spatiale du détecteur CCD dans la direction orthogonale. Cette configuration dépend de la qualité d’imagerie du spectromètre, c’est à dire qu’un point source à la fente d’entrée doit être imagé en un point très petit. En réalité, la performance non idéale de l’optique du spectromètre rend cette configuration pseudo-confocale inférieure à l’approche confocale vraie en matière de résolution spatiale. Du fait du nombre réduit d’éléments optiques, le rendement global est meilleur que celui obtenu avec un design confocal vrai, mais moindre que celui obtenu avec un design non confocal.

Comparison signal to noise performance

Chez Bruker Optics, nous proposons une nouvelle méthode qui fournit la flexibilité nécessaire pour conduire des microanalyses Raman sans compromis. FlexFocus (U.S. Patent number U.S. Pat. 7102746) utilise un système d’ouverture hybride consistant en une série de fentes et de trous servant comme ouverture d’entrée du spectrographe, et fournissant à la demande soit une vraie confocalité soit un fort rendement comme illustré en 2(a) et 2(b). Quand une fente est sélectionnée les données sont collectées avec un très bon rendement mais l’optique n’est pas confocale. Quand un trou est sélectionné les données sont collectées en configuration confocale. Comme le mode confocal possède intrinsèquement un moins bon rendement, il est très intéressant d’avoir un système permettant de basculer rapidement et facilement d’un mode confocal à un mode à haut rendement comme illustré en 3. Quand une résolution en profondeur n’est pas nécessaire les données sont collectées en mode haut rendement, at quand la résolution en profondeur est nécessaire un simple clic dans le logiciel permet de basculer le Senterra en mode confocal avec une excellente résolution en profondeur.


En résumé, FlexFocus évite à la fois l’inconfort d’une approche confocale stricte et le compromis entre résolution en profondeur et rendement de l’approche pseudo-confocale. Avec un haut rendement et ainsi un rapport signal sur bruit élevé, les spectres Raman peuvent être mesurés en routine tout en gardant la possibilité d’utiliser une meilleure confocalité si nécessaire. Une résolution en profondeur meilleure que 2.0 µm peut être obtenue avec un objectif 100x et un trou de 50 µm.

 

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US 6141095; US 7102746