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Fundamentos de Raman

Guía de Microscopía Raman

Explicamos brevemente los fundamentos de la microscopía Raman y examinamos más de cerca por qué algunos aspectos como la resolución espectral y la confocalidad son tan importantes.

Fundamentos de la microscopía Ramn

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¿Qué es la microscopía Raman?

Acerca de la microscopía Raman

La microscopía Raman (μ-Raman) es la combinación de microscopía de luz convencional y una identificación química única por espectroscopía Raman.

Ambas técnicas son bastante poderosas por sí solas, pero cuando se combinan ofrecen la posibilidad de examinar químicamente los objetos más pequeños (> 0,5 m) y, por lo tanto, vinculan la información espectral con la información espacial.

A diferencia de la microscopía infrarroja, los microscopios Raman son mucho más fáciles de implementar porque utilizan luz que es compatible con ópticas de vidrio simples. Por lo tanto, los microscopios Raman se desarrollan a menudo sobre la base de un microscopio óptico de muy alta calidad.

Acerca del muestreo y la confocalidad

Generalmente, y dependiendo de la tarea analítica, no es necesario realizar una preparación elaborada de la muestra en la microscopía Raman. Por lo general, las muestras se colocan sobre la platina tal como son. A lo sumo, se preparan secciones transversales o se cortan piezas grandes a medida para que quepan en la platina.

Sin embargo, también se aplican las mismas restricciones que en la espectroscopía Raman y la muestra no debe mostrar fluorescencia fuerte o absorbancia en la longitud de onda de excitación.

Algunas muestras requieren un microscopio Raman confocal, que ofrece resolución espacial en las tres dimensiones. De esta manera, se puede medir dentro de envases (por ejemplo, viales de vidrio) o caracterizar muestras en 3D.

Calibración de un microscopio Raman

Para obtener resultados precisos y fiables en μ-Raman, es esencial una calibración precisa de la longitud de onda. Hay muchos cambios operativos en un microscopio Raman que pueden tener consecuencias más o menos graves en términos de calibración del número de onda.

La recalibración se realiza tradicionalmente midiendo un estándar de silicio, pero los microscopios modernos ofrecen calibración continua para la máxima comodidad.

Si no se calibra continuamente, la recalibración debe hacerse regularmente incluso después de ajustes del instrumento aparentemente menores como el láser, la apertura o cambios de red, choques y vibraciones repentinas o variaciones de temperatura, para garantizar datos espectrales óptimos.

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¿Qué es la resolución espectral? ¿Qué es la resolución espacial?

Esta figura muestra la diferencia entre medir tripticeno con una resolución de 4,0 cm-1 (rojo) y una resolución de 1,5 cm-1 (azul). Está claro que en este caso 1,5 cm-1 resuelve ciertas bandas que de otro modo no podrían distinguirse.

La resolución espectral describe la capacidad de resolver entidades espectrales en sus elementos individuales. Si es demasiado pequeña, algunas señales espectrales desaparecen "bandas" amplias.

Si es demasiado grande, la medición tarda mucho más de lo necesario sin ninguna ventaja para el usuario. Por lo tanto, es importante saber qué resolución espectral es ideal para la muestra en particular. Lo que hace que la resolución "demasiado baja" o "demasiado alta" depende de la aplicación respectiva y la tarea analítica en cuestión.

La resolución espacial es importante porque influye en la nitidez con la que vemos los objetos. En la microscopía Raman, es vital distinguir diferentes estructuras en una muestra. Por lo tanto, cuanto mejor sea la resolución espacial, más detallada será la información obtenida.

La resolución lateral y axial está determinada por varios parámetros. Para lograr la resolución más alta en ambas áreas, se debe utilizar un microscopio Raman confocal. Normalmente, la resolución espacial es un parámetro decisivo en las imágenes de Raman.

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¿Qué es la confocalidad? ¿Por qué es tan importante en microscopía Raman?

En la microscopía óptica, la confocalidad significa que un punto de muestra iluminado y una apertura circular o "pinhole" en la trayectoria del haz comparten el mismo punto focal. En términos prácticos, en lugar de toda la muestra, sólo una pequeña parte está iluminada por una fuente de luz en forma de punto. A continuación, el "pinhole" bloquea la luz desenfocada, aumentando así el contraste y la profundidad de campo.

¿Qué es la Microscopía Raman confocal?

Este principio se puede aplicar a la espectroscopía Raman, mejorando así la resolución espacial a lo largo de los ejes x, y (lateral) y z (profundidad), al tiempo que permite hacer un perfil de profundidad. Los microscopios Raman, sin embargo, pueden diferir en su diseño confocal.

Verdadero diseño confocal

La mayor ventaja de un verdadero microscopio confocal Raman es el control independiente de la resolución espacial y espectral. Esto se logra colocando una apertura circular ("pinhole") delante de la apertura de entrada del espectrómetro. Los "pinhole" variables controlan el grado de confocalidad, mientras que la apertura de entrada controla la resolución espectral del espectrómetro. La desventaja de este diseño son las dificultades encontradas al tratar de mantener ambas aperturas alineadas para mantener un rendimiento óptimo.

Diseño pseudo-confocal

En una configuración simplificada, la resolución espacial se puede controlar mediante una combinación de la rendija de entrada en una dirección y la resolución espacial del detector CCD en la dirección ortogonal. Las limitaciones del espectrógrafo conducen a un rendimiento inferior cuando se trata de resolución espacial, pero al reducir el número de elementos ópticos en este tipo de configuración, el rendimiento general se mejora considerablemente.

Diseño híbrido-confocal (FlexFocus)

Dado que ambos diseños ofrecen ventajas obvias, un microscopio Raman se puede equipar con un sistema de apertura híbrido que contiene un conjunto de "pinholes" y rendijas que pueden actuar como la apertura confocal y la apertura de enrtada al espectrógrafo. Este diseño híbrido combina las ventajas de los dos diseños y permite el acceso bajo demanda a una verdadera configuración confocal o de alto rendimiento.

 

Diferencias entre un microscopio de luz tradicional y confocal.
Espectro rojo: tiempo de adquisición de 10 segundos, "pinhole" de 50 micras. Espectro azul: tiempo de adquisición de 1 segundo, rendija de 50 micras.

Preguntas frecuentes sobre microscopía Raman

La gota que colmó el vaso

Preguntas frecuentes sobre microscopía Raman

¿Cuáles son las ventajas de la espectroscopía Raman

Raman tiene varias ventajas importantes en comparación con otras técnicas de espectroscopía vibracional de absorción como FTIR y NIR. A diferencia de la absorción, el efecto Raman es la luz inelástica que se dispersa en una muestra. Como resultado, la espectroscopía Raman requiere ninguna o poca preparación de la muestra en la medición de sólidos, líquidos y gases. No sólo directamente, sino también a través de ventanas transparentes como el vidrio y el plástico. El agua tiene muy baja señal Raman y, por lo tanto, la espectroscopía Raman puede detectar fácilmente compuestos que se disuelven en agua sin interferencias fuertes. Eso hace que la espectroscopía Raman sea muy adecuada para muestras biológicas en estado natural.

¿Cuánto tiempo se tarda en adquirir un espectro Raman?

El tiempo de exposición depende de muchos factores, como la calidad espectral esperada, la potencia del láser y la sección transversal de muestra para la dispersión Raman. Por lo general, se pueden adquirir espectros Raman de buena calidad en pocos segundos.

¿Se pueden obtener espectros raman a partir de una mezcla de materiales?

El espectro Raman contiene información sobre todas las moléculas presentes. Por lo tanto, los espectros Raman obtenidos de la mezcla contienen picos de varias moléculas. Si se conocen los espectros de los componentes, se puede generar información cuantitativa sobre la composición.

¿Qué más información aporta el Raman, aparte de la estructura química?

La espectroscopía Raman puede proporcionar, directa o indirectamente, diversa información como isótopos en moléculas, alotropías, cristalinidad, polimorfismo, dopaje de cristales, tensión, presión y temperatura.

¿La espectroscopía Raman es cuantitativa?

La intensidad de un espectro es lineal a la concentración. La relación entre la intensidad máxima y la concentración se puede calibrar con muestras conocidas. En las mezclas, los picos Raman proporcionan información cuantitativa sobre la concentración de compuestos al mismo tiempo.

¿Cuál es la mejor longitud de onda láser para mi aplicación?

Desafortunadamente, la mejor longitud de onda láser para una aplicación específica no siempre es obvia. Se deben considerar muchas variables del sistema para optimizar la longitud de onda de excitación en un experimento de espectroscopía Raman. La eficiencia de la dispersión, la influencia de la fluorescencia, la eficiencia del detector, así como la disponibilidad de un sistema rentable y fácil de usar, son los principales aspectos que deben tenerse en cuenta. La longitud de onda más utilizada resultante es 785 nm y/o 523 nm. El 532 nm es especialmente adecuado para materiales inorgánicos, por ejemplo, grafeno y fullerenos.

¿Cuál es la potencia láser típica para las mediciones de Raman?

La potencia láser en la muestra en un microscopio Raman es típicamente desde el nivel de sub-mW a unas pocas decenas de mW. La intensidad de Raman es directamente proporcional a la potencia del láser. Sin embargo, hay un mayor riesgo de daño de la muestra cuando se utiliza una potencia de láser alta. La potencia del láser se puede reducir para evitar daños en la muestra, pero al hacer esto necesitamos más tiempo de exposición para adquirir espectros de buena calidad.