Guide pour la microscopie Raman

La microscopie Raman utilise la même technique que la spectroscopie Raman pour identifier les composés chimiques d'un échantillon. Tout d'abord, un laser (généralement un laser vert de 532 nm) illumine l'échantillon, interagit avec lui et diffuse sa lumière à sa surface. La lumière laser peut être diffusée de deux manières : la diffusion Rayleigh et la diffusion Raman.

La lumière diffusée Raman est utile pour l'analyse chimique. Ce type de diffusion est inélastique, ce qui signifie que la fréquence, la longueur d'onde et la couleur de la lumière diffusée Raman sont différentes de celles du faisceau lumineux d'origine.

Lors d'une expérience Raman, la lumière diffusée Raman est détectée pour créer le spectre Raman. Ce spectre est propre aux composés chimiques présents dans l'échantillon et constitue donc une « empreinte chimique » permettant d'identifier, de quantifier et de caractériser tous les composés chimiques présents dans l'échantillon.

Grâce à la microscopie Raman, nous pouvons analyser tout ce qui est accessible par la lumière laser. Cela signifie que la microscopie Raman peut analyser tout échantillon placé sur la platine porte-échantillons, sans aucune préparation. Elle peut même être utilisée pour analyser des échantillons dans des flacons en verre, dans des emballages transparents ou immergés dans l'eau.

La spectroscopie Raman présente quelques limites, qui s'appliquent également à la microscopie Raman. Bien que la spectroscopie Raman puisse être utilisée pour analyser tous types d'échantillon, certains composés chimiques ne présentent pas un signal Raman suffisamment puissant pour obtenir un spectre de haute qualité ; ils sont donc difficiles à analyser par spectroscopie Raman.

La fluorescence constitue également un problème majeur en spectroscopie Raman. Si un échantillon présente une fluorescence, la lumière émise est bien plus intense que l'effet Raman, ce qui rend les pics Raman difficiles à distinguer du bruit.

La plupart des expériences Raman utilisant un laser dans le visible de plus il est assez facile de combiner un spectromètre Raman et un microscope. Après tout, les microscopes sont conçus pour fonctionner en lumière visible. Le seul critère à prendre en compte est le type de microscope à utiliser, car il existe de nombreux modèles différents. La plupart des microscopes Raman utilisent un microscope confocal pour optimiser la résolution et la qualité spectrale.

Nous aborderons donc naturellement la conception confocale sur notre site Web.

La première partie du microscope est la platine porte-échantillon. Une fois l'échantillon placé sur la platine, nous pouvons l'observer au microscope. De là, nous pouvons sélectionner une région d'intérêt pour l'analyse.

La lumière du laser est ensuite dirigée vers l'échantillon et focalisée par l'objectif. La lumière laser interagit avec l'échantillon et se diffuse sur lui, et toute la lumière diffusée revient à travers l'objectif.

Cette lumière diffusée est composée de lumière Raman et de lumière Rayleigh, mais seule la lumière Raman est utile pour l'analyse chimique. La lumière Rayleigh est donc éliminée par un filtre. La lumière Raman diffusée restante est focalisée par un pinhole confocal et dirigée vers le spectromètre, qui la sépare par longueur d'onde et la détecte.

Une fois la diffusion Raman détectée, le spectre Raman est créé. Ce spectre contient une mine d'informations chimiques permettant d'identifier et de caractériser les composés chimiques présents dans la région d'intérêt. Grâce à un logiciel, ces composés peuvent même être identifiés automatiquement.

Bien que le laser le plus couramment utilisé en spectroscopie et microscopie Raman soit un laser vert de 532 nm, ce n'est pas la seule option. D'autres lasers fréquemment utilisés pour les expériences Raman incluent un laser bleu de 488 nm, un laser rouge de 633 nm et un laser infrarouge de 785 nm. Différents échantillons peuvent nécessiter des lasers différents afin d'optimiser la sensibilité et la résolution, et d'éviter la fluorescence. C'est pourquoi de nombreux microscopes Raman sont équipés de plusieurs lasers et qu'il est essentiel de pouvoir passer de l'un à l'autre rapidement et facilement !

Comme la lumière d'un microscope Raman traverse généralement l'objectif avant d'atteindre le détecteur, celui-ci a un impact important sur la résolution spatiale du microscope Raman. En particulier, l'ouverture numérique de l'objectif détermine la quantité de lumière qui le traverse ainsi que la profondeur de la focale. Plus l'ouverture numérique de l'objectif est élevée, plus la résolution spatiale du microscope Raman est élevée.

Le réseau est la partie du spectromètre qui sépare la lumière par longueur d'onde avant la détection. Un instrument Raman comporte généralement plusieurs réseaux présentant des densités de raies différentes. La densité de raies du réseau correspond à la dispersion de la lumière sur le détecteur. Cette dispersion modifie la résolution spectrale, c'est-à-dire la qualité de l'observation des pics individuels du spectre Raman. Modifier la résolution spectrale peut permettre d'examiner en détail des parties spécifiques du spectre Raman ou d'affiner une expérience avec différents lasers.

Nous avons mentionné précédemment que la plupart des microscopes Raman sont des microscopes confocaux. Mais qu'est-ce qu'un microscope confocal et quels sont ses avantages en microscopie Raman ?

Lorsque nous utilisons le laser pour éclairer un point sur l'échantillon, il n'interagit pas seulement avec la surface. Il peut également sonder l'échantillon assez profondément, selon sa composition. Cependant, lorsque nous sélectionnons une région à analyser, nous ne recherchons que la lumière correspondant au plan focal étudié.

L'avantage du microscope confocal est d'utiliser un pinhole pour empêcher la lumière floue d'atteindre le détecteur. En supprimant cette lumière floue, on peut améliorer la résolution spatiale, c'est-à-dire la netteté de l'image produite par le microscope. Ceci est particulièrement utile en imagerie Raman, où une haute résolution spatiale est nécessaire pour créer des images chimiques détaillées.

Le pinhole confocal peut également améliorer la qualité du spectre Raman lui-même en supprimant la lumière de fluorescence. Bien qu'il soit généralement possible d'atténuer la fluorescence en utilisant un laser de longueur d'onde différente, ce n'est pas toujours possible. Ainsi, en supprimant la lumière de fluorescence, il est plus facile d'obtenir un spectre Raman de qualité.

Un dernier avantage du pinhole confocal est qu'il permet de déplacer le plan focal. Autrement dit, il permet d'analyser sélectivement la lumière correspondant à différentes profondeurs de l'échantillon, permettant ainsi une analyse tridimensionnelle.

Un microscope confocal implique certains compromis. Il existe donc plusieurs façons d'intégrer cette conception dans un microscope Raman : une conception véritablement confocale, une conception pseudo-confocale et une conception hybride-confocale.

La conception véritablement confocale fonctionne exactement comme décrit ci-dessus : un pinhole confocal supprime la lumière floue avant qu'elle ne soit envoyée au spectromètre, ce qui améliore la résolution spatiale.

Cependant, lorsque la lumière pénètre dans le spectromètre, elle traverse également une fente qui l'élimine encore davantage. Cette fente d'entrée contrôle la résolution spectrale, c'est-à-dire la qualité de la visualisation des pics individuels sur les spectres Raman. Le pinhole confocal et la fente d'entrée doivent être alignés pour que le microscope fonctionne correctement. Cependant, cet alignement est difficile à maintenir, ce qui diminue le rendement du microscope.

La conception pseudo-confocale contourne ce problème en supprimant le pinhole confocal. Cette conception simule l'effet du pinhole confocal en plaçant la fente d'entrée et le détecteur orthogonalement l'un par rapport à l'autre afin d'éliminer la lumière floue. En simplifiant la conception du microscope, le débit est augmenté au détriment de la résolution spatiale.

Les deux conceptions présentent des avantages, et c'est pourquoi la conception hybride-confocale combine ces atouts pour permettre une véritable microscopie confocale ou un haut débit. Pour ce faire, elle utilise un réseau hybride de pinhole et de fentes pouvant servir de fente d'entrée ou de pinhole confocal.

La microscopie Raman présente deux avantages majeurs : la commodité d'une approche « viser et déclencher » pour l'analyse chimique et la possibilité d'analyser même les objets les plus petits (> 0,5 µm). Grâce à ces avantages, la microscopie Raman est utilisée dans un large éventail de secteurs. Par exemple, elle peut être utilisée pour le contrôle qualité et l'analyse des défaillances, où de petits défauts peuvent être analysés de manière sélective sans endommager l'échantillon.

Bien entendu, les microscopes Raman sont également utilisés pour l'imagerie, permettant de créer des images chimiques. L'imagerie chimique avec Raman permet de distinguer des espèces chimiques qui se ressemblent au microscope ou d'observer la distribution des produits chimiques dans un échantillon.

L'utilisation principale d'un microscope Raman ne se limite pas à la création de spectres Raman, mais permet également de créer des images chimiques détaillées. Dans ces images, chaque pixel contient un spectre Raman. Les différents composés de ces spectres sont différenciés et se voient attribuer des couleurs différentes. Cela permet de visualiser et d'analyser précisément la nature et la structure de l'échantillon.

Quels sont les avantages de la spectroscopie Raman

L'effet Raman présente plusieurs avantages majeurs par rapport aux autres techniques de spectroscopie vibrationnelle, telles que la spectroscopie IRTF et NIR.

Contrairement à l'absorption, l'effet Raman est la diffusion inélastique de la lumière par un échantillon. Par conséquent, la spectroscopie Raman ne nécessite aucune préparation d'échantillon, voire peu, pour la mesure des solides, des liquides et des gaz. Non seulement directement, mais aussi à travers des fenêtres transparentes comme le verre et le plastique. L'eau présente un signal Raman très faible ; la spectroscopie Raman permet donc de détecter facilement les composés dissous dans l'eau sans forte interférence. Cela rend la spectroscopie Raman particulièrement adaptée aux échantillons biologiques à l'état natif.

Combien de temps faut-il pour acquérir un spectre Raman ?

Le temps d'exposition dépend de nombreux facteurs, tels que la qualité spectrale attendue, la puissance du laser et la section efficace de l'échantillon pour la diffusion Raman. En général, des spectres Raman de bonne qualité peuvent être acquis en quelques secondes.

Peut-on obtenir des spectres Raman à partir d'un mélange de matériaux ?

Le spectre Raman contient des informations sur toutes les molécules mesurées. Par conséquent, les spectres Raman obtenus à partir d'un mélange contiennent des pics de diverses molécules. Connaître les spectres des composants permet de générer des informations quantitatives sur la composition.

Quelles autres informations la spectroscopie Raman peut-elle détecter, outre la structure chimique ?

La spectroscopie Raman peut fournir, directement ou indirectement, diverses informations telles que les isotopes des molécules, les allotropes, la cristallinité, le polymorphisme, le dopage du réseau cristallin, la tension, la pression et la température.

La spectroscopie Raman est-elle quantitative ?

L'intensité d'un spectre est linéaire par rapport à la concentration. La relation entre l'intensité du pic et la concentration peut être étalonnée à partir d'échantillons connus. Dans les mélanges, les pics Raman fournissent simultanément des informations quantitatives sur la concentration des composés.

Quelle est la meilleure longueur d’onde laser pour mon application ?

Malheureusement, la longueur d'onde laser la plus adaptée à une application spécifique n'est pas toujours évidente. De nombreuses variables doivent être prises en compte pour optimiser la longueur d'onde d'excitation dans une expérience de spectroscopie Raman. L'efficacité de diffusion, l'influence de la fluorescence, l'efficacité du détecteur, ainsi que la disponibilité d'un système économique et facile à utiliser sont les principaux aspects à prendre en compte. Les longueurs d'onde les plus utilisées sont 785 nm et/ou 523 nm. La longueur d'onde de 532 nm est particulièrement adaptée aux matériaux inorganiques, tels que le graphène et les fullerènes.

Quelle est la puissance laser typique pour les mesures Raman ?

Sur un microscope Raman, la puissance laser appliquée à l'échantillon varie généralement de moins d'un milliwatt à quelques dizaines de milliwatts. L'intensité Raman est directement proportionnelle à la puissance laser. Cependant, une puissance laser élevée augmente le risque d'endommager l'échantillon. Il est possible de réduire la puissance laser pour éviter d'endommager l'échantillon, mais cela nécessite un temps d'exposition plus long pour obtenir des spectres de bonne qualité.