Основы Романа

Путеводитель по Раман микроскопии

Мы кратко объясним основы раманского микроскопии и более подробно рассмотрим, почему такие вещи, как спектральное разрешение и конфокаличность, так важны.

Основы рамановской микроскопии

Приступим

Что такое рамановская микроскопия?

О Рамановской микроскопии

Рамановская микроскопия (µ-Раман) представляет собой комбинацию обычной оптической микроскопии и уникальной химической идентификации с помощью рамановской спектроскопии.

Оба метода достаточно эффективны сами по себе, но в сочетании они дают возможность химического исследования мельчайших объектов (> 0,5 мкм) и, таким образом, комбинируют спектральную информацию с пространственной.

В отличие от инфракрасной микроскопии, Рамановские микроскопы гораздо проще в применении, поскольку в них  используется излучение, подходящее дляв простой стеклянной оптики. Поэтому Рамановские микроскопы часто создаются на основе оптических микроскопов достаточно высокого качества.

О выборке и конфокалии

Как правило, и в зависимости от аналитической задачи, никаких сложных преперпараций выборки в Раман микроскопии не требуется. Как правило, образцы помещаются под микроскопию, как есть. В большинстве случаев, поперечные сечения подготовлены или большие заготовки разрезаются до размера, чтобы поместиться на сцене.

Тем не менее, те же ограничения образца, как в Раман спектроскопии по-прежнему применяются и образец не может показать сильную флуоресценцию или поглощение восклицательной длины волны.

Некоторые образцы требуют конфокального рамановского микроскопа, который предлагает пространственное разрешение во всех трех измерениях. Таким образом, вы можете измерить внутри контейнеров (например, стеклянные флаконы) или охарактеризовать образцы в 3D.

Калибровка Рамановского микроскопа

Для получения точных и надежных результатов с Рамановского микроскопа необходима точная калибровка по оси длин волн. Многие изменения в работе Рамановского микроскопа обычно достаточно серьёзно влияют на точность по шкале волновых чисел.

(Повторная) калибровка выполняется путем измерения кремниевого стандарта, но современные микроскопы предполагают непрерывную калибровку для максимального удобства.

Если калибровка не выполняется непрерывно, повторная калибровка должна выполняться регулярно даже после кажущихся незначительными перенастроек прибора, таких как изменение лазера, диафрагмы или решетки, внезапные удары и вибрации, а также температурные сдвиги и колебания, чтобы обеспечить оптимальные спектральные данные.

Углубимся в детали

Что такое спектральное разрешение? Что такое пространственное разрешение?

На рисунке показана разница между измерением триптицена с разрешением 4,0 см-1 (красный) и разрешением 1,5 см-1 (синий). Понятно, что в этом случае 1,5 см-1 решает больше полос, которые в противном случае не могли бы быть различимы.

Спектральное разрешение определяет способность разделять близко расположенные тонкие пики поглощения на спектре. Если оно слишком низкое, некоторые спектральные пики превращаются в широкие «полосы».

Если разрешение слишком высокое, измерение займет намного больше времени, без каких-либо преимуществ для пользователя. Поэтому важно знать, какое спектральное разрешение идеально подходит для конкретного образца. Что делает разрешение «слишком низким» или «слишком высоким», зависит от соответствующей аналитической задачи.

Пространственное разрешение важно, поскольку оно определяет, насколько резко мы видим объекты. В Рамановской микроскопии крайне важно различать различные структуры в образце. Следовательно, чем лучше пространственное разрешение, тем больше деталей изображения мы видим.

Латеральное и аксиальное разрешение представляют собой различные параметры. Для достижения наивысшего разрешения в обоих случаях необходимо использовать конфокальный Рамановский микроскоп. Обычно пространственное разрешение является решающим параметром при построении Рамановских изображений.

Получение в деталях

Что такое конфокаличность? Почему это так важно для Романа?

В оптической микроскопии, confocality означает, что освещенный образец пятна и отверстие отверстие в пути луча оба имеют один и тот же координационный центр. В практическом плане, вместо всего образца, лишь небольшая часть освещается точечным источником света. Затем пинхол блокирует нецеленаправленный свет, тем самым увеличивая контрастность и глубину резкости.

Что такое конфокальные Раман микроскопии?

Этот принцип может быть применен к рамановской спектроскопии, тем самым повышая пространственное разрешение вдоль x,y- (боковой) и z-оси (глубина), а также позволяя профилирование глубины. Раман микроскопы, однако, могут отличаться по своему конфокальный дизайн.

Истинный конфокальный дизайн

Самым большим преимуществом истинного конфокального раманского микроскопа является независимый контроль пространственного и спектрального разрешения. Это достигается путем размещения отверстия отверстие перед спектрометром входной щели. Переменные отверстия контролируют степень конфокальности, в то время как входная щель контролирует спектральное разрешение спектрометра. Недостатком этой конструкции являются трудности, с которыми сталкиваются при попытке сохранить оба отверстия идеально выровнены для поддержания оптимальной производительности.

Псевдо-конфокальный дизайн

В упрощенной конфигурации пространственное разрешение может управляться сочетанием входной щели в одном направлении и пространственным разрешением детектора CCD в ортогоническом направлении. Ограничения спектрографа приводят к низкой производительности, когда дело доходит до пространственного разрешения, но за счет сокращения количества оптики в псевдо-конфокальных установки, общая пропускная способность значительно улучшается.

Гибридно-конфокальный дизайн (FlexFocus)

Так как оба, высокая желоба и истинный конфокальный дизайн предлагают очевидные преимущества, Раман микроскоп может быть оснащен гибридной диафрагмы массив, содержащий набор пинхолов и щелей, которые могут выступать в качестве конфокального диафрагмы и спектрографа entranc. Этот гибридный дизайн сочетает в себе преимущества этих двух конструкций и позволяет по требованию получить доступ к истинной конфокальные или высокой пропускной способности установки.

Различия между традиционным и конфокальный световой микроскоп.
Красный спектр: 10 секунд времени приобретения, 50 мкм пинхол. Синий спектр 1 секунда времени приобретения, 50 мкм щели.

Раман Микроскопия часто задаваемые вопросы

Напоследок

Часто задаваемые вопросы о рамановской микроскопии

В чем преимущества рамановской спектроскопии?

Рамановская спектроскопия имеет несколько основных преимуществ по сравнению с другими методами колебательной спектроскопии, такими как ИК-Фурье спектроскопия и спектроскопия ближнего ИК-диапазона. В отличие от поглощения ИК-излучения, эффект комбинационного рассеяния света (Раман) представляет собой неупругое рассеяние света на образце. Рамановская спектроскопия не требует или требует незначительной подготовки проб при измерении твердых веществ, жидкостей и газов, не только напрямую, но и через прозрачные окна, такие как стекло и пластик. Вода имеет очень низкий сигнал комбинационного рассеяния света, и поэтому спектроскопия комбинационного рассеяния чувствительна к соединениям, растворенные в воде, без сильных помех. Это делает рамановскую спектроскопию применимой для биологических образцов в их естественном состоянии.

Сколько времени нужно, чтобы получить рамановский спектр?

Время экспозиции зависит от многих факторов, таких как ожидаемое качество спектра, мощность лазера и сечение рамановского рассеяния образца. Обычно спектры комбинационного рассеяния хорошего качества можно получить в течение нескольких секунд.

Можно ли получить спектры комбинационного рассеяния для смеси материалов?

Рамановский спектр содержит информацию обо всех молекулах образца. Следовательно, спектры комбинационного рассеяния света, полученные для смеси, содержат пики от различных молекул. Если спектры отдельных компонентов известны, можно получить количественную информацию о составе.

Какую еще информацию можно обнаружить с помощью комбинационного рассеяния, кроме химической структуры?

Рамановская спектроскопия может прямо или косвенно отразить различную информацию, такую как наличие различных изотопов в молекулах, аллотропы, кристалличность, полиморфизм, легирование кристаллической решетки, напряжение, давление и температура.

Является ли рамановская спектроскопия количественной?

Интенсивность спектральных пиков линейно зависит от концентрации. Соотношение между интенсивностью пика и концентрацией можно калибровать с помощью известных образцов. В смесях пики комбинационного рассеяния, помимо прочего, несут количественную информацию о концентрации соединений.

Какая длина волны лазера лучше всего подходит для моих задач?

Наилучшая длина волны лазера для конкретной задачи не всегда очевидна. Для оптимизации длины волны возбуждения необходимо учитывать многие параметры. Эффективность рассеяния, влияние флуоресценции, эффективность детектора, а также экономическая целесообразность и простота работы являются основными аспектами, которые необходимо учитывать. По статистике наиболее часто используемый длины волн возбуждения 785нм и/или 523нм. 532 нм особенно подходит для неорганических материалов, например графена и фуллеренов.

Какова типичная мощность лазера для рамановских измерений?

Мощность лазера на образце в рамановском микроскопе обычно составляет от долей мВт до нескольких десятков мВт. Рамановская интенсивность прямо пропорциональна мощности лазера. Однако существует повышенный риск повреждения образца при использовании мощного лазера. Мощность лазера можно уменьшить, чтобы избежать повреждения образца, но при этом нам потребуется более длительное время экспозиции, чтобы получить спектры хорошего качества.