应用笔记 - 磁共振

生物制药工业中的NMR新视界

单克隆抗体(mAb)是生物制药行业的一个主要焦点,代表着药物开发中最有前途和最令人兴奋的领域之一。这些蛋白质可以被设计成几乎能识别任何抗原,并可大规模量产。

单克隆抗体(mAb)是生物制药行业的一个主要焦点,代表着药物开发中最有前途和最令人兴奋的领域之一。这些蛋白质可以被设计成几乎能识别任何抗原,并可大规模量产。

然而迄今为止,由于其尺寸大,用现有技术对mAb进行高分辨率3D结构表征基本上是不可行的。例如,核磁共振(NMR)波谱会产生太多叠加共振,因而难以解读。此外,因为同位素13C和15N的天然丰度很低,生物分子的2D NMR通常需要应用同位素标记。

因为mAb的结构与其功能密切相关,因而对它的三维结构表征对于安全性和有效性都是非常重要的。不正确的蛋白质折叠会导致副作用,例如不希望出现的免疫响应,因此非常需要能在质量控制设置中验证mAb结构的方法。

Luke Arbogast及其同事的一项最新研究表明,NMR波谱方面的进步是如何开始应对这一挑战的。

在这项研究中,研究人员选择将观察甲基残留物作为采集被称为RM8670的候选mAb结构“指纹”的一种方法。他们使用Bruker Avance III 900 MHz波谱仪进行无同位素标记的实验。它配备了三共振冷冻探针,这是一项有助于使天然同位素丰度波谱更为可信的技术进步。对甲基基团的研究,还有助于他们利用13C同位素自然丰度更高(1.1%)的优势(高于15N同位素0.37%的自然丰度)。

研究者使用被称为gsHSQC(选定梯度、灵敏度增强型异核单量子相干)的序列,对其mAb完整样本进行2D NMR,使之获得足够高质量的波谱以分配并分析谱峰。然而,他们的优化实验耗时达12小时。

因此,他们在已分裂成其组成要素Fab和Fc结构域的mAb片段加以重复。这个实验现在只需耗费4.5个小时,而且研究人员还能证明这些片段所产生的波谱非常类似于完整mAb所产生的波谱。该团队描述道,这表明切割后的蛋白质片段可作为NMR实验中完整蛋白质的良好替代物。

研究人员发现还可以进一步缩短实验时间。他们通过结合快速采集技术来实现这一点,这有助于依靠非均匀采样提高天然同位素丰度波谱法的速度。经过对六个组合的测试,使用快速采集技术SOFAST-HMQC 进行50%非均匀采样的最短时间为34分钟。

研究人员报告了他们在分析化学中的发现,解释了诸如可促进自然丰度波谱法的冷冻探针以及更大的高波谱仪场强可用性方面的发展,使NMR与以往相比成为比质量控制设置更为实用的工具。他们总结道,所获得的结果支持了这一观点,并表明该方法将在生物治疗产业中发现一系列用于蛋白质结构评估的用途。

参考文献

  • Arbogast LW、Brinson RG和Marino JP;“在自然丰度上通过2D 13C NMR绘制单克隆抗体结构”;Analytical Chemistry 2015;87: 3556-3561。
  • Goswami S、Wang W、Arakawa T等;“基于mAb的治疗药物的发展和挑战”;Antibodies 2013;2: 452-500。
  • Poppe L、Jordan JB、Rogers G等;“与多维NMR法相比,1D NMR在蛋白质药物高阶结构指纹图谱采集上的分析优越性”;Anal Chem 2015;87: 5539-5545。