DNP实验的样品制备策略

动态核极化（DNP）大大提高了固体核磁共振（ssNMR）研究的灵敏度，对于生物材料和药物制剂，更是如此。DNP-NMR的优点之一是提高数据采集速度，加快检测固态材料的速度。

为什么要采用DNP-NMR？

在结构生物学和材料科学的研究中，NMR波谱是测定化合物结构组分的前沿技术。虽然NMR对实现这一目标至关重要，但它对所研究的核的小磁矩部分敏感性较低。反过来，核自旋储层的小极化会导致NMR信号强度微弱，致使结果不甚理想。

DNP-NMR的使用可以通过协助将电子自旋储层的大波耳兹曼极化转移到核自旋储层，来显著提高NMR信号强度。DNP-NMR实验的机理因固态和液态样品而异。这些机制如下：

• 液体NMR：奥弗豪塞效应
• 固体NMR：交叉效应、固体效应和热混合

DNP-NMR实验样品制备

制备样品需要一些工具，包括布鲁克 DNP-NMR波谱仪、转子和适当的样品溶剂。此外，必须存在不成对的电子，尤其是自由基必须添加到样品中，以使DNP功能正常。

在DNP实验中使用的偏光剂通常是基于氮氧化物的自由基，非反应性基团，通常能够耐受氧化，同时能在不同范围的水溶剂中保持相当水平的溶解度。最常见的基于氮氧化物的自由基包括AMUPol、TEMPO和TOTAPOL。理想情况下，样品的浓度范围为5-20 mM。如果浓度太低，则可能存在的电子太少，无法推动DNP增强。

在溶剂中溶解自由基是制备DNP实验样品的第一步。要将自由基传递到样品中，最有效的方法是采用溶液形式。使用低温保护剂溶剂对于在低温下保护样品至关重要。例如，如果在样品中使用蛋白质，则该蛋白质可能需要在低温下置于冷冻保护剂溶剂中，以防止由于冰晶的形成而导致蛋白质变性。

如果样品不溶于水溶液，如膜蛋白和纤维，则需要采取进一步的步骤使自由基均匀分布。虽然自由基存储溶液有助于这些样品的混合或混悬，大多数却是通过一种自由基溶液进行离心。较高浓度的自由基可达到约10 mM。可能需要用含大量脂质的样品来降低甘油，因为这些脂质通常含有它们自己的低温保护剂特性。

在用布鲁克固体DNP-NMR波谱仪制备实验样品的过程中，研究人员首先从质量相当于全转子质量的固态粉末样品开始。然后，将溶剂缓慢添加到固态样品中，将样品和溶剂混合在一起形成湿糊。这种糊状物应该略稠，不含多余的水分。可添加更多样品以降低湿度，继续确保混合物保持糊状稠度。然后将这种糊状混合物填充到整个转子中，以进行NMR实验。

用于DNP-NMR实验的布鲁克NMR波谱仪

布鲁克固体DNP-NMR波谱仪为提高固体核磁研究中的信号强度而设计。应用包括：

• 生物固体材料的DNP-NMR：小型肽、膜蛋白和可溶性蛋白增强。
• 材料科学：在分子水平上，布鲁克的DNP-NMR波谱仪可用于表征通常用于药物输送、纯化设备和催化的杂化二氧化硅材料。
• 13C脯氨酸的DNP增强SPMAS：将极化剂加入共享溶剂或通过在样品上使用自由基。在低温（100至120开尔文）、MAS下测量样品，然后进行NMR实验。
• Expansin蛋白与植物细胞壁的结合：布鲁克 DNP-NMR波谱仪可使用REDOR过滤器从expanin 13C信号中选择信号，从而帮助检测与植物细胞壁混合的expansin。在REDOR过滤器之后，自旋扩散显示出细胞壁多糖和expansin之间的相关性。

参考文献：

• Liao SY, Lee M, Wang T, Sergeyev IV, Hong M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. J Biomol NMR. 2016;64(3):223-237.
• Le D, Casano G, Phan TNT. Optimizing Sample Preparation Methods for Dynamic Nuclear Polarization Solid-state NMR of Synthetic Polymers. Macromolecules. 2014;47(12):3909–3916.