Protein identification header

深度和速度:对于“鸟枪法”蛋白组学研究的突破

自下而上的蛋白质鉴定是生物质谱学实验中极具挑战性的任务,要求在综合峰容量、速度和选择性等指标的情况下,对高度复杂的蛋白质酶切混合物中对尽可能多的肽段进行测序。timsTOF Pro具有独一无二的捕集离子淌度分离技术(TIMS),它提供了一个额外的分离维度,使得峰容量和灵敏度有了前所未有的提高,并实现了平行累积连续碎裂工作流程(PASEF),该流程在没有灵敏度和分辨率损失的情况下、100%的循环使用率下,MS/MS扫描速度可以大于100 Hz (实际使用扫描速度平均为120 Hz)。

高度复杂性问题

在典型的“鸟枪法”蛋白组学实验中,肽段来源于上百万个蛋白质异构体,多肽浓度的动态范围高达10个数量级、并且通常用2小时色谱梯度对这些多肽进行分离,。这对质谱仪来讲是一个极大的挑战;它要求质谱仪必须尽量多地隔离、碎裂并检测所产生的数百万个肽段。为了产生丰富的蛋白质鉴定信息,加入离子淌度作为一个额外的分离维度,具有显著提高峰容量的潜力。然而,这种提高是不能以牺牲采集速度或灵敏度为代价的。

TIMS-PASEF 解决方案

TIMS的独特设计,使得PASEF采集方法能对从淌度分离池中洗脱出来的离子簇(以2-5 ms的宽度被洗脱)进行浓缩,并使MS/MS数据采集速度超过100赫兹, 从而使循环利用率接近100%。额外的分离维度是在提高了采集速度和灵敏度的基础之上获得的,而TOF分析器允许在全范围的一级和二级扫描速度下,仍保持超高的二级分辨率。

TimsTOF System 02 RZ
TIMS的工作过程:离子的累积时间为100毫秒,在离子淌度的维度被分离开并被释放出来,淌度峰宽为3-5毫秒,促进了灵敏度和选择性的提高。
PASEF的工作过程:每一个从tims分析池中流出的、宽度为3-5毫秒的淌度峰都经过母离子筛选,展现出前所未有的二级采集速度。

PASEF用于深度的蛋白组学研究

带有PASEF采集模式的timsTOF Pro提供卓越的蛋白质鉴定性能和分析的深度。当与纳升流速的nanoElute UHPLC和CaptiveSpray的离子源相连接的时候,timsTOF Pro能在90min分离梯度内从200纳克、HeLa细胞的酶切物中鉴定出超过5000种蛋白质。

P A S E F
标准的PASEF采集方法: 1.1秒为一个循环,包含一个MS扫描事件,10个PASEF事件。一次MS扫描只需100毫秒,每个PASEF也为100毫秒,并且每个PASEF又包含12个二级扫描。

PASEF用于提升通量的“鸟枪法”蛋白组学研究

出色的采集速度缩短了梯度时间并增加通量,与此同时,保持了前所未有的分析深度。在30min 内可以从100纳克的Hela细胞酶切物中,鉴定出接近4000个蛋白质组。

PASEF用于提高蛋白质鉴定的灵敏度

TIMS淌度分离极大地提高了灵敏度,使得低浓度样品的分析成为可能。使用标准的PASEF方法,经过一定的调谐,可以在60分钟分离梯度内从12ng Hela细胞酶切物中,鉴定出接近2900个蛋白质组。

PEAKS Database Search results RZ
对一个三蛋白组混合物的无标定量结果。总的蛋白上样量为150纳克,分离方法为90分钟梯度。MaxQuant用于后期数据处理。

完美的临床蛋白组学比较

PASEF最终使得临床蛋白组学变成现实。体系的采集速度和灵敏度的组合,可以重复性地、在5分钟分离梯度内从50ng的Hela细胞中,鉴定出超过1400个蛋白质组。

For Research Use Only. Not for Use in Clinical Diagnostic Procedures.