Les bases du Raman

Guide de la microscopie Raman

Nous expliquons brièvement les principes fondamentaux de la microscopie Raman et examinons de plus près pourquoi des choses comme la résolution spectrale et la confocalité sont si importantes.

Bases de la microscopie Raman

Introduction

Qu’est-ce que la microscopie Raman?

À propos de la microscopie Raman

La microscopie Raman (μ-Raman) est la combinaison de la microscopie conventionnelle et d’une identification chimique unique par spectroscopie Raman.

Les deux techniques sont assez puissantes à elles seules, mais lorsqu’elles sont combinées, elles offrent la possibilité d’examiner chimiquement les plus petits objets (> 0,5 μm) et donc, elles relient l'information spectrale à l’information spatiale.

Contrairement à la microscopie infrarouge, les microscopes Raman sont beaucoup plus faciles à appliquer parce qu’ils utilisent une lumière compatible avec une optique verre. Par conséquent, les microscopes Raman sont souvent développés sur la base d’un microscope optique de très haute qualité.

À propos de l’échantillonnage et de la confocalité

En général et en fonction de la tâche analytique, aucune préparation d’échantillon très élaborée n’est nécessaire dans la microscopie Raman. Habituellement, les échantillons sont placés directement sur la table du microscope. Tout au plus, les sections transversales sont préparées ou des grandes pièces sont coupées à la taille pour s’adapter à la table.

Toutefois, l'échantillon peut générer une forte fluorescence ou ne pas provoquer d'absorption à la longueur d’onde d'excitation tel que la microscopie Raman classique peut occassionner.

Certains échantillons nécessitent de la microscopie Raman confocal, qui offre une résolution spatiale dans les trois dimensions. De cette façon, vous pouvez mesurer à l’intérieur des contenants (p. ex. flacons de verre) ou caractériser des échantillons en 3D.

Étalonnage d’un microscope Raman

Pour des résultats précis et fiables en μ-Raman, un étalonnage précis de l’axe des longueurs d’onde est essentiel. De nombreux changements opérationnels d’un microscope Raman ont généralement des conséquences plus ou moins graves en termes d’étalonnage.

Un (re)étalonnage est effectué en mesurant un standard en Silicium, mais les microscopes modernes offrent un étalonnage continu pour une commodité maximale.

S’il n’est pas calibré en continu, le recalibrage doit être effectué régulièrement et même après des ajustements d’instruments apparemment mineurs comme des changements de laser, d’ouverture ou de réseau, des chocs et des vibrations soudains ainsi que des changements de température et des variations, afin d’assurer des données spectrales optimales.

Détails

Qu’est-ce que la résolution spectrale? Qu’est-ce que la résolution spatiale?

Cette figure montre la différence de mesure du triptycène avec une résolution de 4,0 cm-1 (rouge) et 1,5 cm-1 (bleu). Il est clair que, dans ce cas précis, la résolution à 1,5 cm-1 résout d’autres bandes qui autrement ne pourraient pas être distinguées.

La résolution spectrale décrit le pouvoir de séparation d'un spectromètre ainsi plus la résolution spectrale est grande, plus le spectre obtenu est détaillé. Inversement si la résolution est trop faible, certains bandes spectrales disparaissent dans une large « bande ».

Si la résolution est trop grande, la mesure prendra également beaucoup plus de temps sans aucun avantage pour l’utilisateur. Il est donc important de connaître la résolution spectrale idéale pour l’échantillon. Ce qui rend la résolution « trop faible » ou « trop élevée » dépend de l’application et de la tâche analytique à accomplir.

La résolution spatiale est importante car elle influence la façon dont nous voyons les objets. En microscopie Raman, il est essentiel de distinguer les différentes structures d’un échantillon. Par conséquent, plus la résolution spatiale est grande, plus l’information obtenue est détaillée.

La résolution latérale et axiale est déterminée par divers paramètres. Pour obtenir la plus haute résolution dans les deux domaines, un microscope confocal Raman doit être utilisé. En règle générale, la résolution spatiale est un paramètre décisif dans l’imagerie Raman.

Entrer dans les détails

Qu’est-ce que la confocalité? Pourquoi est-ce si important pour Raman ?

En microscopie Optique, la confocalité signifie une illumination et une détection limités à un même volume de taille réduite passant par un pinhole. En terme pratique, au lieu de mesurer l'échantillon dans sa globalité seule une petite partie est illuminée comme une source ponctuelle. Le pinhole bloque une partie de la lumière parasite, augmentant le contraste et la profondeur de champ.  

Qu’est-ce que la microscopie confocale Raman?

Le principe peut être appliqué à la spectroscopie Raman en améliorant la résolution spatiale le long des axes latéraux (x,y) et en profondeur (z) tout en faisant des mesures  de profil de profondeur. La microscopie Raman peut néanmoins différer des conceptions confocales classiques.

Véritable conception confocale

Le plus grand avantage d'un véritable microscope Raman confocal est le contrôle indépendant de la résolution spatiale et spectrale. Ceci est réalisé en plaçant un pinhole devant la fente d'entrée du spectromètre. Les différentes ouvertures de pinhole contrôlent le degré de confocalité et la fente d'entrée contrôle la résolution spectrale. Les inconvénients de cette conception est de maintenir les deux ouvertures parfaitement alignées afin de maintenir des performances optimales.

Conception pseudo-confocale

Dans une configuration simplifiée, la résolution spatiale peut être contrôlée par une combinaison de fente d'entrée dans une direction et de la résolution spatiale du détecteur CCD dans une direction orthogonale. Les limites du spectrographe entraînent des performances inférieures en terme de résolution spatiale mais en réduisant le nombre d'éléments optiques dans la configuration, le flux d'énergie global est considérablement amélioré.

Conception hybride-confocale (FlexFocus)

Etant donné qu'un vrai dispositif confocal offre des avantages évidents, un microscope Raman peut être équipé d'une matrice contenant un ensemble de pinhole et fente pouvant servir de  fente pour la confocalité et fente d'entrée du spectromètre. Cette conception hybride combine les avantages des deux designs et permet un accès à une configuration véritablement confocale ou à une configuration fente pour des flux d'énergie élevée.

 

Différences entre un microscope à lumière traditionnel et confocal.
Spectre rouge : 10 secondes de temps d’acquisition, 50 μm de trou d’épingle. Spectre bleu 1 seconde temps d’acquisition, fente de 50 μm.

FAQ sur la microscopie Raman

Résumés

Questions fréquemment posées sur la microscopie Raman

Quels sont les avantages de la spectroscopie Raman

La spectroscopie Raman a plusieurs avantages majeurs par rapport à d’autres techniques de spectroscopie vibrationnelle comme la spectroscopie d'absorption IR et Proche IR. Contrairement à l’absorption, l’effet Raman est la lumière inélastique que disperse un échantillon. Par conséquent, la spectroscopie Raman ne nécessite aucune ou peu de préparation d’échantillons pour mesurer les solides, les liquides et les gaz. Non seulement directement, mais aussi à travers des fenêtres transparentes telles que le verre et le plastique. L’eau a un signal Raman très faible et donc la spectroscopie Raman peut facilement détecter les composés qui se sont dissous dans l’eau sans interférence. Cela rend la spectroscopie Raman approprié pour les échantillons biologiques dans l'état natif.

Combien de temps faut-il pour acquérir un spectre Raman?

Le temps d’exposition dépend de nombreux facteurs, tels que la qualité spectrale, la puissance laser, et le parcours moyen de l'échantillon pour la diffusion Raman. En règle générale, des spectres Raman de bonne qualité peuvent être acquis en quelques secondes.

Peut-on obtenir des spectres Raman à partir d’un mélange de matériaux?

Le spectre Raman contient des informations sur toutes les molécules qui sont mesurées. Par conséquent, les spectres raman obtenus à partir de mélange contiennent des bandes de diverses molécules. Si les spectres des composants sont connus, des informations quantitatives sur la composition peuvent être obtenues.

Quelles autres informations Raman peut-on obtenir, autres que la structure chimique ?

La spectroscopie Raman peut fournir, directement ou indirectement, diverses informations telles que les isotopes dans les molécules, les allotropes, la cristallinité, le polymorphisme, le dopage dans le réseau cristallin, la tension, la pression et la température.

La spectroscopie Raman est-elle quantitative ?

L’intensité d’une bande dans un spectre est linéaire à la concentration. La relation entre l’intensité maximale et la concentration peut être calibrée à l’aide d’échantillons connus. Dans les mélanges, les pics de Raman fournissent des informations quantitatives sur la concentration des composés en même temps.

Quelle est la meilleure longueur d’onde laser pour mon application?

Malheureusement, la meilleure longueur d’onde laser pour une application spécifique n’est pas toujours évidente. De nombreuses variables doivent être considérées pour optimiser la longueur d’onde d’excitation dans une expérience en spectroscopie Raman. L’efficacité de diffusion, l’influence de la fluorescence, l’efficacité du détecteur, ainsi que les performances du système, sont les principaux aspects à prendre en considération. La longueur d’onde la plus communément utilisée  est 785 nm et/ou 523 nm. Le 532 nm convient particulièrement aux matériaux inorganiques, par exemple le graphène et les fullerènes.

Quelle est la puissance laser typique pour les mesures Raman?

La puissance laser à l’échantillon sur un microscope Raman est généralement de l'ordre du mW jusqu'à quelques dizaines de mW. L’intensité Raman est directement proportionnelle à la puissance laser. Cependant, il y a un risque accru de dommages sur l’échantillon lors de l’utilisation d’une puissance laser trop forte. La puissance laser peut être réduite afin d'éviter les dommages sur l'échantillon, mais ce faisant, le temps d’exposition pour acquérir des spectres de bonne qualité sera plus long.