应用笔记 - 磁共振

通过配体观察NMR进行片段筛选

除了表面等离子体共振(SPR)和X-射线晶体学,配体观察NMR是用于基于片段的药物发现(FBDD)的最流行技术之一。近年来,方法学和技术上的进步已使基于NMR的片段筛选可全自动化进行,并且显著减少了片段和未标记目标蛋白的消耗。
除了表面等离子体共振(SPR)和X-射线晶体学,配体观察NMR是用于基于片段的药物发现(FBDD)的最流行技术之一。近年来,方法学和技术上的进步已使基于NMR的片段筛选可全自动化进行,并且显著减少了片段和未标记目标蛋白的消耗。配体观察NMR不仅可以用作初级筛选工具,而且还可以确认来自热位移等其它筛选方法中的命中,从而得到高质量的命中。此外,所有实验都能以竞争性实验方式进行,其中已知结合物被置换,Kd通过滴定确定。

在这里,我们将展示如何以自动方式设置配体观察NMR筛选实验的各个实际方面,涉及以下三个基本实验:饱和传递差(STD)、水分子配体的梯度光谱观测(waterLOGSY),以及基于驰豫的方法(T1r和T2)。

配体观察NMR筛选实验:

  • 大分子>20 kDa在弛豫(T1和T2)以及奥弗豪塞尔核效应(NOE)方面表现出明显不同于片段(如小分子)的NMR特性。
  • 由于与大分子的相互作用进而改变了片段的可观察NMR参数,因而与目标结合的配体均可与非结合物区分开来,这在所有配体观察筛选实验中都很常见。
  • 使用基于NOE的方法侦测到的命中可以通过使用基于驰豫的方法来加以确认。
  • 在蛋白质上停留期间以及由于结合时的化学交换,小分子适应了目标分子的弛豫特性。这可以用来区分结合物与非结合物。

T2/T1r – 驰豫法

大生物分子的T2和T1r弛豫时间比片段要短得多。通常对两种光谱进行测量和比较,一个具有10毫秒弛豫延迟,而另一个则具有200毫秒弛豫延迟。结合的片段可以通过光谱的比较来识别:

 

waterLOGSY

在WLOGSY实验中,通过NOE使极化从水分子转移到小分子。结合的配体与结合在蛋白质上的水相互作用,而非结合物只能“看见”溶剂水。然而,来自结合水的NOE效应具有与自由水相反的标志。其结果是,来自结合片段的信号与来自非结合物的信号相反。

饱和传递差(STD)

在STD实验中记录了两个光谱,(1)受选择性射频(RF)辐射的生物分子靶标光谱;(2)离共振辐射光谱。

源于RF辐射的靶标饱和通过NOE转移到结合配体上,导致在共振光谱中的强度降低。在(1)与(2)的不同光谱中,只能观察到来自结合物的信号。

 

 

NMR筛选的主要优点

  • NMR技术无需蛋白质特异性设置或关于蛋白质功能的知识,并且可以应用于无法进行生物测定的目标;
  • NMR技术应用于溶液时不受晶体接触或靶标固定化的影响;
  • 可以侦测到低uM到mM的弱结合;
  • 片段的QC,容易识别光谱中的降解

实验参数

在新版本的TopSpin 3.5 PL6中,WRSOY和STD参数集包含了优化的实验设置,以及自动获取和处理的例行程序(rpar WLOGSY_PREP、WLOGSY和STDDIFFESGP.3)。T2和T1r的参数集可根据要求提供(stefan.jehle@bruker.com)。

硬件参数

在新版本的TopSpin 3.5 PL6中,WRSOY和STD参数集包含了优化的实验设置,以及自动获取和处理的例行程序(rpar WLOGSY_PREP、WLOGSY和STDDIFFESGP.3)。T2和T1r的参数集可根据要求提供。

  • 右图为各项实验的正确蛋白质浓度选择指南
  • 蛋白质浓度和以及片段与蛋白质的比率高度依赖于蛋白质的分子量(MW)
  • 蛋白质越大,则应选择更高比例
  • 对于样品可用性低的目标,该比值可高达约1:200
  • 片段式混合物的使用大大缩短了检测时间。每种混合物的典型片段数分别应<10(1H筛选)及<30(19F筛选)

结论

配体观察NMR是一种自动化的片段筛选技术,可在初级和次级筛选中产生高质量的命中。目前,可提供具有优化的测量条件的参数集,这有助于基于NMR的筛选实验的设置,既是新手也可掌握。此外的一个关键优点是来自1D 1H光谱的片段的QC,从而能识别化合物的降解和聚集,避免假阳性。这对于确认通过SPR或热位移进行的初级筛选命中特别有用。

进一步阅读:

A.D. Gossert和W. Jahnke;Prog. NMR Spect.;2016。

作者:

Stefan Jehle(1)、Helena Kovacs(1)、Till Kuehn(1)和Alvar Gossert(2)

(1)布鲁克拜厄斯宾有限公司,瑞士法兰登市伊杜斯特里大街26号,8117(Bruker BioSpin AG, Industriestrasse 26, 8117 Faellanden, Switzerland);

(2)诺华生物医学研究所,瑞士巴塞尔市(Novartis Institutes for BioMedical Research, Basel, Switzerland)。

有关Bruker NMR仪器的更多信息,请联系我们。

X为1D 1H光谱中的缺失或宽峰表示在制备后(红)及四周后(黑)后,含人血清白蛋白(HSA)和酪氨酸的样品的化合物降解或聚集STD参考光谱。由于预期峰的缺失,化合物的降解很容易被鉴定出来。