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Raman Grundlagen

Leitfaden zur Raman-Mikroskopie

Wir erläutern kurz die Grundlagen der Raman-Mikroskopie und schauen uns genauer an, warum Dinge wie Spektralauflösung und Konfokalität so wichtig sind.

Grundlagen der Raman-Mikroskopie

Erste Schritte

Was ist Raman-Mikroskopie?

Über Raman-Mikroskopie

Die Raman-Mikroskopie (μ-Raman) ist die Kombination aus konventioneller Lichtmikroskopie und einer einzigartigen chemischen Identifikation durch Raman-Spektroskopie.

Beide Techniken sind für sich genommen schon recht leistungsfähig, bieten in Kombination jedoch die Möglichkeit auch kleinste Objekte (> 0,5 µm) chemisch zu analysieren. So verknüpft die Raman-Mikroskopie spektrale mit räumlichen Daten.

Raman verwendet Anregungswellenlängen im sichtbaren Bereich des Lichtes, wodurch es mit Glasoptiken voll kompatibel ist. Daher werden Raman-Mikroskope oft auf Basis eines hochwertigen optischen Mikroskops entwickelt. In dieses Mikroskop wird dann ein Raman-Spektrometer integriert.

Über Probenahme und Konfokalität

Im Allgemeinen und je nach analytischer Aufgabe sind in der Raman-Mikroskopie keine aufwendigen Probenpräparationsschritte erforderlich. In der Regel werden Proben unter dem Mikroskop so platziert, wie sie sind. Je nach Probe werden jedoch Querschnitte  vorbereitet oder große Werkstücke so zugeschnitten, dass sie auf dem Probentisch Platz finden.

Allerdings gelten weiterhin die gleichen Probenbeschränkungen wie bei der Raman-Spektroskopie. Die Probe darf also keine starken Fluoreszenz-Effekte oder Absorption der Anregungs-wellenlänge aufweisen.

Einige Proben erfordern ein konfokales Raman-Mikroskop, das räumliche Auflösung in allen drei Dimensionen bietet. Auf diese Weise ist es möglich in Behälter hinein (z.B. Glasfläschchen) zu messen oder Proben in allen drei Raumrichtungen charakterisieren.

Ein Raman-Mikroskop muss kalibriert sein

Für präzise und zuverlässige μ-Raman-Ergebnisse ist eine genaue Kalibrierung der Wellenlängenachse unerlässlich. Viele betriebsbedingte Veränderungen eines Raman-Mikroskops haben mehr oder minder schwere Folgen auf die Wellenzahlkalibrierung.

Eine (Neu-)Kalibrierung erfolgt traditionell durch die Messung eines Siliziumstandards. Modernere Mikroskope bieten eine jedoch eine kontinuierliche Kalibrierung für maximalen Komfort.

Falls das Mikroskop nicht über eine kontinuierliche Kalibrierung verfügt, sollte die manuelle Rekalibrierung regelmäßig und auch nach scheinbar geringfügigen Instrumentenanpassungen oder äußeren Einflüssen durchgeführt werden, zum Beispiel nach Laser-, Blenden- oder Gitterwechsel, plötzlichen Stößen, Vibrationen oder Temperaturänderungen. Nur so können optimale Spektraldaten gewährleistet werden.

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Was ist spektrale Auflösung? Was ist räumliche Auflösung?

Diese Abbildung zeigt den Unterschied zwischen der Messung von Triptyzen mit einer Auflösung von 4,0 cm-1 (rot) und einer Auflösung von 1,5 cm-1 (blau). Es ist klar, dass in diesem Fall 1,5 cm-1 mehr Bänder auflöst, die sonst nicht zu unterscheiden wären.

Die Spektrale Auflösung beschreibt die Fähigkeit eines Raman-Mikroskops, spektrale Signale in ihre einzelnen Elemente aufzulösen. Wenn sie zu klein gewählt wurde, können Spektralsignale in breiten Banden "untergehen".

Falls sie jedoch zu groß gewählt wurde, dauert die Messung viel länger als erforderlich, ohne dass es Vorteile für den Benutzer gibt. Es ist daher wichtig zu wissen, welche Spektralauflösung für die jeweilige Probe ideal ist. Was schlussendlich eine Auflösung "zu niedrig" oder "zu hoch" macht, hängt von der jeweiligen Anwendung und der anstehenden analytischen Aufgabe ab und erfordert oft einiges an Expertenwissen.

Die räumliche Auflösung ist von zentraler Bedeutung, da sie beeinflusst, wie scharf wir Objekte sehen können. In der Raman-Mikroskopie ist es wichtig, verschiedene Strukturen in einer Probe zu unterscheiden. Je besser also die räumliche Auflösung, desto detaillierter die erhaltenen Informationen.

Die laterale und axiale Auflösung wird durch verschiedene Parameter bestimmt. Um die höchste Auflösung in beiden Bereichen zu erreichen, muss ein konfokales Raman-Mikroskop verwendet werden. Typischerweise ist die räumliche Auflösung ein entscheidender Parameter in der Raman-Bildgebung (Raman-Imaging).

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Was ist Konfokalität? Warum ist es so wichtig für Raman?

In der optischen Mikroskopie bedeutet Konfokalität, dass ein beleuchteter Probenpunkt und eine Lochblende innerhalb des Strahlwegs den gleichen Brennpunkt haben. In der Praxis wird statt der gesamten Probe jedoch nur ein kleiner Teil durch eine punktförmige Lichtquelle beleuchtet. Die Lochblende blockiert dann unfokussiertes Licht und erhöht so dann den Kontrast und die Schärfentiefe.

Was ist konfokale Raman-Mikroskopie?

Dieses Prinzip kann auf die Raman-Spektroskopie angewendet werden, wodurch die räumliche Auflösung entlang der x,y- (lateral) und z-Achse (axial) verbessert wird und gleichzeitig eine Tiefenprofilierung ermöglicht wird. Raman-Mikroskope können sich in ihrem konfokalen Design jedoch unterscheiden.

Echtes konfokales Design

Der größte Vorteil eines “echt-“ konfokalen Raman Mikroskops ist die unabhängigkeit von räumlicher und spektraler Auflösung. Dies wird durch das Anbringen einer Lochblende vor dem Spektrometereingangsspalt erreicht. Variable Lochblenden steuern hierbei den Grad der Konfokalität, während der Eingangsspalt die spektrale Auflösung bestimmt. Der Nachteil dieses Designs ist die Schwierigkeit beide Blenden optimal aufeinander abzustimmen, um eine konstant hohe Leistung zu Gewährleisten.

Pseudo-konfokales Design

In einer vereinfachten Konfiguration kann die räumliche Auflösung durch eine Kombination des Eingangsschlitzes in eine Richtung und der räumlichen Auflösung des CCD-Detektors in orthogonaler Richtung gesteuert werden. Spektrographeneinschränkungen führen zu einer schlechteren Leistung, wenn es um räumliche Auflösung geht, aber durch die Reduzierung der Anzahl der Optiken im pseudokonfokalen Setup wird der Gesamtdurchsatz erheblich verbessert.

Hybrid-konfokales Design (FlexFocus)

Da sowohl ein hoher Durchsatz als auch ein echtes konfokales Design offensichtliche Vorteile bieten, kann ein Raman-Mikroskop mit einem Hybrid-Blenden-Array ausgestattet werden, der eine Reihe von Loch- und Schlitzblenden enthält, die als konfokale Blenden und Spektrographen-Eingänge fungieren können. Dieses Hybrid-Design kombiniert die Vorteile der beiden Designs und ermöglicht einen "on-demand" Zugriff auf ein echtes konfokales oder ein Setup für hohen Durchsatz.

 

Unterschiede zwischen einem traditionellen und konfokalen Lichtmikroskop.
Rotes Spektrum: 10 Sekunden Erfassungszeit, 50 m Loch. Blaues Spektrum 1 Sekunde Erfassungszeit, 50 m Schlitz.

Häufig gestellte Fragen zu Raman-Mikroskopie

Der letzte Strohhalm

Häufig gestellte Fragen zur Raman-Mikroskopie

Was sind die Vorteile der Raman-Spektroskopie?

Raman hat im Vergleich zu anderen, absorbtionsbasierten Schwingungs-spektroskopie-Techniken wie FT-IR und FT-NIR mehrere zentrale Vorteile.
Im Gegensatz zur Absorption basiert der Raman-Effekt auf der unelastischen Streuung von Licht. Daher erfordert die Raman-Spektroskopie keine bzw. nur wenig Probenvorbereitung bei der Messung von Feststoffen, Flüssigkeiten und Gasen.

Dabei kann die Probe nicht nur direkt, sondern auch durch transparente Materialien hindurch analysiert werden wie bspw. Glas und Kunststoff. Da auch Wasser nur ein sehr schwaches Raman-Signal kann die Raman-Spektroskopie auch in Wasser gelöste Verbindungen ohne starke Interferenzen analysieren. Dies erlaubt auch die analyse biologischer Proben in ihrem natürlichen medium.

Wie lange dauert es ein Raman-Spektrum zu messen?

Die Belichtungszeit hängt von vielen Faktoren ab, wie z. B. der gewünschten Spektralqualität, der Laserleistung  und natürlich der Probe selbst. Typischerweise können hochwertige Raman-Spektren jedoch in einigen Sekunden erzeugt werden.

Können Raman-Spektren aus einer Mischung von Materialien gewonnen werden?

Das Raman-Spektrum enthält Informationen über alle Moleküle, die gemessen werden. Daher enthalten Raman-Spektren, die aus einer Mischung gewonnen werden natürlich auch Signalanteile aus verschiedenen Molekülen. Wenn die Spektren der Komponenten bekannt sind, können quantitative Informationen über die Zusammensetzung gewonnen werden, sprich wieviel von jedem Stoff sich in der Probe befindet.

Welche Art an Information liefern Raman-Spektren?

Die Raman-Spektroskopie kann direkt oder indirekt verschiedene Informationen liefern, wie über die Isotope in Molekülen, über Allotrope, Kristallinität, Polymorphismus, Kristallgitter & Doping, Materialspannung, Druck und Temperatur.

Ist die Raman-Spektroskopie quantitativ?

Die Intensität eines Spektrums ist linear zur Konzentration. Der Zusammenhang zwischen Bandenintensität und Stoffkonzentration kann also mit bekannten Proben kalibriert werden. In Mischungen liefern Ramanbanden gleichzeitig quantitative Informationen über die Stoffanteile von Verbindungen in einer Probe.

Was ist die beste Laserwellenlänge für meine Anwendung?

Leider ist es selten offensichtlich, welches die beste Laserwellenlänge für eine bestimmte Anwendung ist. Viele Systemvariablen müssen berücksichtigt werden, um die Anregungswellenlänge in einem Ramanexperiment zu optimieren.

Die Streueffizienz, der Einfluss der Fluoreszenz, die Detektoreffizienz sowie die Leistung des Raman-Mikroskop selbst sind die Hauptaspekte, die berücksichtigt werden müssen. Am häufigsten werden jedoch 785 nm oder 532 nm Laser zur Anregung verwendet. Der 532 nm eignet sich besonders für anorganische Materialien, z.B. Graphen und Fullerene.

Was ist die typische Laserleistung für Raman-Messungen?

Die Raman-Intensität ist direkt proportional zur Laserleistung, wobei die verwendete Laserleistung in der Regel vom sub-mW-Niveau bis zu einigen Dutzend mW reicht.
Bei starker Laserleistung besteht jedoch ein erhöhtes Risiko von Probenschäden vor allem bei organischem/biologischem Material.

Wird die Laserleistung jedoch verringert um Probenschäden zu vermeiden, wird gleich-zeitig eine erhöhte Belichtungszeit benötigt, um qualitiv hochwertige Spektren zu gewährleisten. Dies verlängert natürlich die Experimentdauer. Alles in allem sind oft Expertenkenntnisse notwendig, um die optimalen Experimentparameter zu wählen.