高速度高灵敏度4D-蛋白质组学新标准

timsTOF Pro 2

timsTOF Pro 2 由平行累积连续碎裂技术( PASEF® )驱动,使得 4D-蛋白质组学和 4D-脂质组学为无偏向性细胞和血浆蛋白质组学、液体活检多组生物标志物发现,以及整合基因组学、蛋白质组学和表观蛋白质组学拓宽了道路。

4D-组学时代

解锁第四维度的价值

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高亮

timsTOF

4D-组学的重大突破

速度
PASEF 技术实现了在不影响分辨率情况下达到超过 100 Hz 扫描速度。
深度
额外一维离子淌度提高了数据完整性。
高通量
超快数据采集速度使其可以使用短梯度实现生物样本的高通量分析。
耐用性
独特的仪器设计使得其可以连续分析数千个样品,仪器保持稳定的性能而无需清洁。

功能

4D-Proteomics™ 的新标准:更快速度实现蛋白质组全覆盖

基于质谱( MS )的蛋白质组学一次可实现样本里成千上万蛋白的定性和定量。然而,受到目前质谱仪的扫描速度、灵敏度和分辨率的影响,实现蛋白质组的全覆盖

仍然具有挑战性。timsTOF Pro 2 使用平行累积连续碎列( PASEF® )的技术可实现极高的扫描速度和灵敏度,只需要少量样本就可以达到蛋白质组学鉴定新深度。

双 TIMS 和 CCS 的分析


捕集离子淌度谱( TIMS )首先是一项重要的气相分离技术,它是在高效液相色谱( HPLC )和质谱分离的基础上,带来额外一个维度的分离,可大大降低样品分析复杂度,极大提高峰容量和分析物鉴定可靠性。

同样重要的是,TIMS 离子淌度管能对离子实现时间和空间上的聚焦,从而独特地提高灵敏度和扫描速度。

双 TIMS 技术可以实现近乎 100% 的离子利用率,离子在前一根淌度管内累积,在后一根淌度管内根据离子淌度值分批释放。这种平行累积连续碎裂( PASEF® )的过程能够实现碰撞横截面( CCS )的分析。



CCS 额外一个维度信息能够提供很多进一步的分析可能性,可以从复杂数据库实现化合物的高可信度库匹配以及更低的错误发现率( FDRs )。

优化的硬件性能

timsTOF Pro 2 质谱仪整合了新一代 TIMS 分析仪和一个完全重制的不锈钢堆叠环形离子向导( SRIG )。新的设计能够提供三倍高的离子容量。一种新的离子冷却多极杆和改进的离子注入四极杆设计,以及进一步简化的离子光学大大提高了离子从TIMS 模块到 TOF 飞行管的传输效率,进一步最大限度地提高 MS 和 PASEF 

MS/MS 中的离子传输和灵敏度。TIMS 模块独特设计意味离子在前一根淌度管内累积,在后一根淌度管内根据离子淌度值分批释放,可以实现近乎100%的离子利用率,几乎不造成离子的损失。

PASEF®

重新设计的 MS/MS 技术,以满足蛋白组学的速度要求。肽段离子通过捕集离子淌度谱( TIMS ) 分离,洗脱( ~ 100 ms ),并在四极杆飞行时间质谱( QTOF )上进行检测,生成 TIMS MS 热图。在 PASEF® 方法中,相同的 TIMS 分离后的离子又通过四极杆对特定离子进行逐一隔离。母离子和碎片离子谱图按离子淌度值进行对齐。

平行积累连续碎裂( PASEF® )技术实现了 > 100 Hz 的扫描速度, 使用 PASEF® 可以实现多次选择低丰度肽段离子来提高低丰度肽的二级谱图质量。


PASEF® :鸟枪法蛋白质组学的完美选择

由 PASEF® 驱动的 timsTOF Pro 2 可以实现超过 100 Hz 的扫描速度,而不会损失灵敏度和分辨率。这是通过离子在淌度管内的的累积、分离和四极杆隔离能同步进行来实现的。

优势

极高的稳定性和通量

无需清洗

许多用于蛋白质组学应用的 MS 仪器需要每月清洁一次,在大样本组中每天 24 小时

运行。仪器性能下降即使在较短的时间段内也是显而易见的。timsTOF Pro 2 卓越稳定性意味着仪器可以全天运行很多周,而没有明显的信号和其它性能下降。

“ 自 2019 年 2 月我们开始使用 timsTOF Pro 的 26 个月以来,我们已运行了 25,000 多个 LC/MS 样本,其中约 5,000 个样本是不去高丰度的血浆样本。到目前为止,我们的停机时间几乎为零。”

Roman Fischer 博士
牛津大学 Target Discovery 研究所临床蛋白质组学团队负责人

PaSER Run & Done —— 加快4D-蛋白质组学的鉴定速度

PaSER( 实时平行搜索引擎 )是一个结合硬件和软件的解决方案,能够实现基于样本序列管理的实时数据库搜索引擎。

PaSER 以很快的速度就能提供结果,包括 PTM 搜索。通过使用基于 GPU 的搜索,PaSER 在实时或离线模式下可以提供相同的结果,而无需使用简化的算法或中间步骤。PaSER 极快的搜索速度使得在数据采集结束后数秒就能同步拿到搜库结果,真正实现运行并完成! PaSER 有效地打破了大队列样本数据分析通量壁垒。

此外,实时蛋白组学的非标记定量也可以跨越 PaSER 获得的数据结果集,使其瞬间能过渡到定量蛋白质组学。通过 TIMS Viz 使得淌度偏移质量对齐( MOMA )变得可视化 ,从而用户可以鉴定和识别只有 4D-Omics 才能看到的共洗脱多肽。

dia-PASEF 增加鉴定可信度

dia-PASEF比传统的 DIA 方法有更高灵敏度和选择性,是因为它将 PASEF 原理也应用进来,结合了 DIA 的优点和 PASEF 离子利用率高的优势。

TIMS 分离提高了选择性,而且可以将单电荷母离子排除掉,从而降低本底噪音干扰。

利用分子量和碰撞横截面 CCS 值的相关性,dia-PASEF 能够实现高可信度化合物鉴定。在 LC-MS/MS分析中, dia-PASEF 能够采集包含 m/z,离子淌度值( CCS ),保留时间和离子强度的 4D 数据。

应用

前所未有的蛋白质覆盖深度


凭借强大的 SRIG( 不锈钢堆叠环形离子向导 )装置和新优化的 dda-PASEF 方法 ,timsTOF Pro 2 单针能够达到前所未有的蛋白组学覆盖深度。使用自制 HEK 酶切样本, 上样 200 ng,使用 Aurora - 25cm 色谱柱,在 60 分钟梯度下能够鉴定 超过 7,000个 蛋白和 60,000 条多肽。

因此 timsTOF Pro 2 可以通过数据库搜索和运行之间的匹配,无需任何谱图库,在一些日常细胞系蛋白组定量实验中实现很高的蛋白覆盖深度。

超高灵敏度的高通量靶向蛋白质组学

和常规的靶向蛋白组学分析技术( SRM 和 PRM )相比,prm-PASEF 在单针中可极大提高监测多肽数目,同时不影响仪器选择性或灵敏度。

靶向质谱( MS )技术是蛋白质组学实验中一种强大的技术,用来验证大队列样本中的候选生物标志物。与数据依赖采集( DDA )和数据非依赖采集( DIA )相比,这可以增加检测灵敏度。可是该技术受到在单针中监测离子数目和液相分离出峰时长以及整体灵敏度间的折中限制。只有通过更长的色谱分离时长或降低质谱的灵敏度和选择性,才能获得大量目标肽的完整数据。

prm-PASEF 可以极大地提高单针中靶向监测的多肽数目,这得益于布鲁克 timsTOF Pro 2 的第四维分离可以极大提高选择性和灵敏度, PASEF 技术带来的速度可以增加靶向分析离子数量。

超高灵敏度应对最困难的分析挑战

随着某些特定细胞、少量细胞群或生物穿刺样本的生物研究越来越重要,低样本量蛋白组定量变得至关重要。而如此低的样本量对于质谱灵敏度提出了很高要求。使用高灵敏度的质谱仪对如此低的样本量进行原型定量至关重要。timsTOF Pro 2 上样 200 ng HeLa 样本,使用 Aurora - 25cm 色谱柱,在 30 分钟梯度下使用 PaSER 能够鉴定超过 74,200 个蛋白和接近 30,000 条多肽。

dia-PASEF —— 高通量定量蛋白质组学中实现无与伦比的数据完整性和分析深度

使用标准 dia-PASEF 方法多针测试结果有着很高重复性。三种不同的 dia-PASEF 窗口设置下使用 Aurora-25cm 柱在 60 分钟梯度下可实现接近 8,000 个蛋白定量和超过 70,000 条多肽,而且有极高的定量准确性。

高灵敏度磷酸化蛋白组学分析和同分异构体分离

支持 CCS 的近邻位磷酸化位点定量
dia-PASEF 在 timsTOF Pro 2 上的高灵敏度、扫描速度和重现性甚至可以实现低样本量的磷酸化蛋白质组学分析。例如可以实现小鼠脑样本起始总蛋白仅为 25 μg 的磷酸化蛋白质组的非标记定量。使用 Evosep 每天 30 个样本的分析方法,三次重复可鉴定出多达 4,473 个 unique 磷酸化多肽。这些结果为针刺活检的应用带来了希望,可以用信号转导的信息补充癌症蛋白质基因组学数据。这些结果为针刺活检的应用带来了希望。此研究结果由 Stefan Tenzer 教授提供。

分析样本量有限时的细胞信号传导
当肽段在色谱上发生共洗脱时,由于等重性和信号重合,不能测量 CCS 值的传统蛋白质组学是不能实现磷酸化肽异构体的定量的。PASEF 技术使得基于 TiO2 富集时,使用 150 ug 蛋白富集起始量就能够鉴定 27,768 个磷酸化肽,展现了淌度偏离质量对齐( MOMA )的优点。1,946 条鉴定的共洗脱异构体中,20% 的异构体可以被TIMS 完全分离,这可以使得我们可以更好地理解邻位蛋白磷酸化位点信息。

" 除了高灵敏度之外,timsTOF Pro 质谱仪的另一独特之处在于其基于气相的位置异构磷酸化多肽分离能力,从而为理解信号传导通路提供更详细的信息。"

Stefan Tenzer 教授
Institute for Immunology, University Medical Center of the Johannes-Gutenberg University, Mainz, Germany

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*仅供研究使用,不能用于临床诊断程序。