THE STANDARD FOR HIGH SPEED, HIGH SENSITIVITY, 4D-PROTEOMICS

timsTOF Pro 2  

最新のParallel Accumulation SErial Fragmentation (PASEF®)テクノロジーを搭載したtimsTOF Pro 2は、4D-マルチオミクスアプリケーションへの道を切り開くものです。実績のある堅牢性、高感度、高速MS/MS取得により、timsTOF Pro 2は、4D-プロテオミクス、4D-メタボロミクス、4D-リピドミクスに最適なプラットフォームとなります

4D-Omicsの時代

4次元の価値を解き放つ

TIMSTOF

4D-Omicsにおける飛躍的な進歩

スピード
PASEFテクノロジーは、分解能に影響を与えることなく、100Hz以上のシーケンシングスピードを実現します。
深さ
イオンモビリティを追加することで、データの完全性を高めることができます。
堅牢性
独自の装置設計により、洗浄することなく数千のサンプルに対する堅牢な性能と日常的な操作を実現しています。

高速・高感度4D-マルチオミクスの新基準

液体クロマトグラフィー(LC)と質量分析(MS)の組み合わせは、様々なオミクス分野におけるゴールドスタンダードとなっています。しかし、現在の質量分析計の速度、感度、分解能には限界があり、複雑な生体試料中のプロテオームやメタボロームを網羅することは依然として困難です。

Trapped Ion Mobility Spectrometry(TIMS)を加えることで、Parallel Accumulation Serial Fragmentation(PASEF®)取得法を開放し、最小限のサンプル量で極めて高いMS/MSスピードと感度を実現することができます。

デュアルTIMSとCCSに対応した分析

まず第一に、TIMSは気相での分離技術です。これにより、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)や質量分析に加え、分離の次元を追加することでサンプルの複雑性を解決し、ピークキャパシティと化合物特性評価の信頼性を向上させることができます。

また、TIMS装置では、所定の質量と移動度のイオンを蓄積・濃縮することで、独自の高感度化と高速化を実現しています。


デュアルTIMSテクノロジーにより、前段にイオンを蓄積し、後段のイオンを移動度に応じて順次放出することで、ほぼ100%のデューティサイクルを実現しています。このPASEF®(Parallel Accumulation Serial Fragmentation)プロセスは、衝突断面積(CCS)分析を可能にします。

 

CCSによる分析は、化合物同定の高い確実性から、大規模なデータセットにおける信頼性があるライブラリのマッチング及び低い偽発見率(FDR)に至るまでの多くの分析の可能性を広げます。

PASEF®

timsTOF Pro 2は、3倍のイオンキャパシティを持つ革新的なデュアルTIMSアナライザーを搭載しています。シンプルなイオン光学系により、イオンの移動と感度を最大限に高め、4D-マルチオミクスの新たなスタンダードを確立しました。PASEF® は、オミクスアプリケーションに求められる高速測定を満たすために再設計されたMS/MS技術です。トラップイオンモビリティスペクトロメトリーを用いて分離・溶出(~100 ms)されたイオンは、四重極飛行時間(QTOF)で検出され、TIMS MSヒートマップを生成します。PASEF®(MS/MS)は、同じTIMS分離を利用して、イオンを連続的に断片化します。四重極はMS/MSの溶出時に特定のイオン種を分離し、すぐに次のプリカーサーに移行する。親イオンとフラグメントイオンのスペクトルは、モビリティ値でアライメントされます。timsTOF Pro 2は、PASEF® モードにおいて120Hz以上のシーケンス速度を達成することができます。さらに、低濃度成分は複数回MS/MSで選択することにより、スペクトル品質を向上させることができます。

同定の信頼性を高めるdia-PASEF

Data-Independent Acquisition (dia)-PASEF®は、PASEF®の原理を応用し、DIAの利点とPASEF®の固有のイオン効率を組み合わせることにより、従来のDIAアプローチよりも感度と選択性に優れています。液体クロマトグラフィー質量分析計(LC-MS/MS)のdia-PASEF®による測定では、m/z、イオンモビリティ(CCS)、保持時間、強度を含む完全なデータキューボイドが作成されます。

TIMS分離は、選択性を高め、一価のプリカーサーイオンをフラグメンテーションから除外し、ノイズからシグナルを濃縮することでサンプルをクリーンアップします。

dia-PASEF®は、デュアルTIMSファンネルから得られる分子量とCCS情報の相関を利用することで、信頼性の高い同定を可能にします。

ペプチドおよびタンパク質のシーケンスカバレッジを最大化

timsTOF Pro 2の堅牢なステンレススチール製Stacked Ring Ion Guide (SRIG) 構成と最適化された標準dia-PASEF®メソッドにより、シングルショットプロテオミクスでこれまでにない深さのプロテオームカバレッジが実現しました。timsTOF Pro 2 の nanoElute 付き PepSep 25 cm カラムと TIMScore™ 搭載スペクトルライブラリを使用して、200 ng の K562 溶液から約 9000 のタンパク質群を 35 分間のグラジエント (~30 サンプル/日) で同定しました。

timsTOF Pro 2は、一般的な細胞株のプロテオーム定量実験において、スペクトルライブラリーを必要とせず、データベース検索とラン間のマッチングにより、直接的に詳細なプロテオームカバレッジを提供します。異なるデータベース検索ストラテジーにより、非常に同等の結果が得られました。リアルタイムでのタンパク質同定を可能にするBruker ProteoScapeとMaxQuantは、タンパク質とペプチドレベルの両方で同様のIDナンバーを示しました。

K562 digest, 35 min gradient (≒ 30 Sample per day) K562消化物のdia-PASEF®解析。データ処理は、Bruker ProteoScape with TIMS DIA-NNを使用し実行。

前例のない感度でのハイスループットなターゲットプロテオミクス

prm-PASEF® は、TIMSを4次元の分離とすることで比類ない選択性を実現します。TIMSカートリッジでイオンを時間集束して感度を高め、PASEF® による高速化でプリカーサのターゲット数を増やすことが可能です。timsTOF Pro 2のユニークな選択性と高感度を損なうことなく、1回の測定で数百のプリカーサーをターゲットにすることができます。

感度、スピード、選択性を兼ね備えたprm-PASEF® 取得法は、ターゲット数が多い場合や短いクロマトグラフィーグラジエント(5分未満)でのアプリケーションにおいて、高い再現性と正確な定量を実現しました。

Targeted protoemics analysis in a colorectal cancer plasma study. 1565 precursors (Heavy/Light) from 565 proteins were targeted in a prm-PASEF® experiment, using Biognosys’s PQ500 kit.

「我々はブルカーと密接に協力し、prm-PASEF® をゼロから構築してきました。このコラボレーションを通じて、我々はprm-PASEF® が提供するスピード、感度、堅牢性という世界クラスの組み合わせに感銘を受けてきました。私たちは、timsTOF Pro 2でこの性能を次のレベルに引き上げることができることに興奮しています。」

Jarrod A. Marto, Ph.D., Associate Professor, Department of Pathology, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, USA

4D-メタボロミクスで広がる可能性

ノンターゲットメタボロミクスにおいて、高いMS/MSカバレッジは化合物アノテーションの重要な要素です。当社の最適化された4D-Metabolomicsメソッドは、同じサンプル分析で定量MSプロファイリングデータとMS/MSフラグメンテーションスペクトルの両方を提供し、低濃度の分析物でも大部分の特徴をカバーすることが可能です。PASEF® は、フラグメンテーションの前にイオンモビリティで選別することで、クリーンで明確なフラグメントスペクトルを得ることができます。

PASEF® は、各化合物を個別にモビリティで選択し、フラグメンテーションを行うことができるため、クリーンなフラグメントスペクトルを得ることができます。マトリクス由来のMS/MSフラグメントを除去することで、MetaboScape® におけるプロアジフェンのライブラリマッチングが向上し、結果の信頼性が高まります。

 

4D-Lipidomicsでより高い信頼性

プロテオミクスサンプルと同様に、脂質抽出物も脂質の構造多様性に起因する高いサンプル複雑性を持っています。高品質のMS/MSスペクトルは、信頼性の高い脂質アノテーションを得るために不可欠です。PASEF® は、脂質アノテーションの信頼性をさらに高めるために使用できるCCS対応ワークフローを可能にします。

timsTOF Pro 2で取得したリピドミクスデータは、MetaboScape® で簡単に解析できます。このツールは、公開されているフラグメンテーションルールと新しいCCS予測ツールを活用したライブラリーフリーアノテーションツールを搭載しており、取得した4次元データを最大限に活用することができます。

PASEF® は、モビリティ分離を用いることで、10倍以上のプレカーサーをフラグメンテーションすることができます。これにより、重なり合ったコンタミを除去し、同重体の脂質も異性体の脂質も分離することができます。得られたMS/MSスペクトルは、各脂質クラスに対してユニークなフラグメントを示し、信頼性の高いアノテーションを実現します。

同重体脂質のMOMA(Mobility Offset Mass Aligned)データ (A) 逆相LCから共溶出した2つの同重体リン脂質のモビリティ分離を示すヒートマップ。(B) モビリティ分離後のクリーンなPASEF® MS/MS スペクトル。(C) NIST SRM 1950 (ESI ポジティブモード) の異なるグラジエント時間でのユニークな脂質アノテーション。

「PASEF® は、MS2スペクトルを持つ脂質のプリカーサーカバレッジを70%まで向上させることができます。これらのMS2スペクトルは、脂質を正しく同定するために不可欠です。それに加えてCCSを使用することで、RT、MS、MS/MSに情報のレイヤーを追加し、アノテーションの信頼性がさらに高まります。」

Dr. Michael Witting, Co-Head Metabolomics and Proteomics Core, Helmholtz Zentrum Munich, Neuherberg, Germany

複雑なマトリックスにおける超ハイスループットで確実なスクリーニングと定量化

timsTOF Pro 2システムの卓越したスピードは、GC-APCIまたはUHPLC VIP-HESIのデータ取得で完全な未知のスクリーニングを可能にします。TASQ® ソフトウェアとの組み合わせで、ブルカーはデータ取得から自動データ解析までの完全なソリューションを提供します。

抽出イオンクロマトグラムにモビリティフィルタを適用することで、干渉を除去し、複雑なマトリックスでも感度が向上します。これは、1 ng/mL 濃度のタマネギ中の Thiacloprid のトレースではっきりと確認できます。下のトレースは、モビリティの範囲が徐々に狭くなるようにフィルタリングされており、MRSQC スコアの緑色で示されるように、TargetScreener データベースと完全に一致させることができます。

極めて高い堅牢性とスループット

最小限のクリーニング
プロテオミクスアプリケーションに使用されている多くのMS装置は、大規模なサンプルコホートで24時間稼働させる場合、毎月のクリーニングが必要です。

短時間であっても性能低下は顕著です。timsTOF Pro 2 の優れた堅牢性は、24時間365日、何週間にもわたって稼働させても、感度やその他の性能指標が目立って低下しないことを意味します。

「26ヶ月前の2019年2月にtimsTOF Proを使い始めてから、約5000のdepletion処理無しの血漿消化物を含む25000以上のLCMSサンプルを実行し、これまでダウンタイムはほぼゼロでした。」

Roman Fischer, Ph.D.
Associate Professor in Clinical Proteomcs, Target Discovery Institute, University of Oxford, United Kingdom

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