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HDXソリューション-タンパク質のコンフォメーションを解き明かしましょう

  • バイオ医薬品候補タンパク質の立体構造の「ホットスポット」を特定する手法をお探しですか?
  • バイオ医薬品の製剤過程や保存中に立体構造の変化が起きていないか確認する手法をお探しですか?

  • タンパク質とリガンド(タンパク質と薬物分子)の相互作用や薬効との関連性などについて、より深く知ることができる手法をお探しですか?

ブルカーのHDXソリューションは上記のような手法を提供します。タンパク質のコンフォメーションを解き明かし、再現性良く信頼できる結果を提供します。

バイオ医薬開発におけるチャレンジ

ファーマ(あるいはバイオファーマ)の研究者は、相互作用や pH や温度などそれに影響を及ぼすもの、さらにはバイオ医薬品のコンフォメーションなどについてよく理解し、知識を深めることを要求されています。それらは非常にチャレンジングな課題であり、タンパク質の高次構造を探索し、相互作用をモニターし、あるいはまたエピトープ・マッピングを行うために、研究者たちは実に様々な分析手法を用いています。 

最近、このようなコンフォメーション解析に役に立つ分析手法として、様々な分析手法の中から水素-重水素置換質量分析(HDX-MS)が注目を集めています。しかし、HDX-MSはつい最近まで主としてアカデミアで実施されているのみでした。オートメーションが普及しておらず、データ解析ツールも充分でなく、さらには信頼に足るモノアイソトピック質量の同定が必要であったためです。

HDXソリューションによって、自動的に、迅速に、再現性良く、定量的に構造を解き明かします

ブルカーのHDXソリューションは、LEAP HDx PAL と先進のブルカー maXis II ETD、完成度の高いSierra Analyticsの解析ソフト(HDExaminer)を組み合わせたものです。maXis IIの優れたETD性能は、これまでのペプチド・マッピングの能力を維持しながら、ミドルダウンやトップダウンにおいて比類ないシークエンス回収率を誇ります。ペプシン消化物によるボトムアップ解析からETDフラグメンテーションを用いるミドルダウンやトップダウン解析への変化は、コンフォメーション研究に革命をもたらすかも知れません。ブルカーのHDXソリューションは、正確なモノアイソトピック質量特定とH/D比に基づく定量解析とを兼ね備えた、全自動で再現性の高いワークフローです。これにより、信頼性の高いデータで自信を持って生体分子の構造に迫ることができるのです。

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E.coli HtpGタンパク質の結晶構造に基づく2時構造。色はH/D交換度を表す。(クリックすると拡大)

全自動HDX前処理ロボットとUHR-QTOF技術を組み合わせることの意義

全自動HDX-MS実験を実施するための主要コンポーネント(クリックして拡大)
全自動HDX-MS実験を実施するための主要コンポーネント(クリックして拡大)

Ultra-High Resolution (UHR)-QTOFは、MS測定においてもMS/MS測定においても高選択性と高感度を両立することができるため、バイオ医薬の特性解析に広く利用されています。UHR-QTOFはモノアイソトピック質量を正確に測定できるだけでなく、正しい同位体パターン(True Isotopic Pattern)を再現することができるため、正確で信頼性の高いH/D比の算出には必須であり、これによりHDX-MS実験から定量性の高い結果を得ることができるのです。

[そして今や、正確なモノアイソトピック質量特定と電子移動解離(ETD)のような先進的なフラグメンテーション手法がUHR-QTOFで組み合わされたことにより、更に詳細な情報が得られるようになりました。もはや揺らぎの影響を受けるペプチド単位の重水素置換に頭を悩ませる必要はありません。重水素置換されたアミノ酸残基をピンポイントで特定できるようになったのです。

しかし、HDX-MSがバイオファーマ研究領域でルーチンとして利用できる信頼に足る分析手法として受け入れられるためには、サンプル調整からLC/MSデータ取得までをタイムコースに沿って自動的に実施し、取得したデータから容易に結果を導く機能が必要とされています。

The Bruker HDX Solution for Automated Structural Conformation Characterization

The Bruker HDX Solution is a complete toolkit combining the LEAP HDx PAL, UHPLC pump, the Bruker maXis II ETD and Sierra Analytics HDExaminer software. 

By utilizing the most advanced (MS) vendor independent HDX system, the LEAP HDx PAL, robustness and reliability are built-in as standard. The LEAP HDx PAL automates the HDX experimental workflow, schedules and performs labelled experiments, followed by quenching and injection under cold conditions.

High Quality Chromatographic and MS Data

Representative Heat Map produced in Sierra Analytics HDExaminer software showing the differences in deuterium uptake after incubation for 5 s to 86400s
Representative Heat Map produced in Sierra Analytics HDExaminer software showing the differences in deuterium uptake after incubation for 5 s to 86400s (click to enlarge)

Chromatographic separation under UHPLC conditions followed by mass spectrometric detection using the Bruker maXis II with its sub-ppm mass accuracy, high sensitivity and isotopic fidelity guarantees, high quality data and ultimately confidence in the H/D ratios.

 

Market-leading ETD capabilities open-up a new era in HDX-MS experiments. The ability to enhance knowledge by probing at the residue level not just the peptide level potentially gives additional specificity and highlights potential hotspots more readily. Top-down and middle-down approaches are also possible and provide complementary data to that obtained from traditional bottom-up pepsin-digestion based HDX-MS experiments.

 

Visualization and Insights

The information and insights gained following data analysis can be used to probe protein structure conformational changes in the presence of a perturbation.  

 

The regions responsible for the changes can be readily visualized by linking to crystal structure visualization programs such as PyMol.

Crystal structure representations of the protein HtpG undergoing structural changes in the presence of ATP based on data from HDX-MS experiments.
Crystal structure representations of the protein HtpG undergoing structural changes in the presence of ATP based on data from HDX-MS experiments (click to enlarge)

Innovative, Intelligent Sample Scheduling

One of the key features in bringing HDX-MS into the age of automation and into (bio)pharmaceutical laboratories is the innovative scheduling software, Chronos, included with the LEAP HDx PAL.

 

This software maximizes the chromatographic throughput and hence lab productivity by the intelligent organization and scheduling of the sample preparation steps including labelling, incubation, digestion and quenching.

Optimized Scheduling afforded by the Chronos software provided with the LEAP HDx PAL
Optimized Scheduling afforded by the Chronos software provided with the LEAP HDx PAL (click to enlarge)

The Most-widely Used HDX-MS Data Interpretation Software


The ability to interpret and analyze the mass spectral data providing a comprehensive picture of the deuteration uptake behaviour of a protein is provided by Sierra Analytics HDExaminer software. This is the most-widely used vendor-neutral solution available on the market and has a high degree of functionality and is easy-to-use.

 

Watch the video on Sierra Analytics HDExaminer software to find out how it can help you interpret the results of HDX-MS experiments: 

The HDX Workflow

HDX-MS experiments are often a series of time-course experiments performed under at least 2 different conditions e.g. at 2 different pH levels, or at 2 different temperatures, or with and without an additive. 

 

Once the conditions for the series of experiments have been ascertained, the information is transferred to the Chronos scheduling software for automatic calculation of the pre-incubation, labelling, quenching, digestion and separation times. 

Flowchart representing the tasks performed automatically by the HDX Solution for a complete HDX-MS experiment of HtpG/ HtpG+ATP
Flowchart representing the tasks performed automatically by the HDX Solution for a complete HDX-MS experiment of HtpG/ HtpG+ATP (click to enlarge)

Once everything is set-up and the acquisition started the system runs automatically preparing, injecting and analysing all the samples in the series.  After the mass spectrometric data has been collected this is uploaded to the HDExaminer software for calculation of the H/D ratios, generation of the deuteration uptake plots and production of heat maps. These data can then be exported to a 3-D crystal structure program such as PyMol for a 3-D visualization of the regions affected by the change being studied.
 

HDX Solution Workflow (click to enlarge):

HDX Solution Workflow
HDX Solution Workflow

Bruker Daltonics services are performed by factory trained and certified engineers. DIN EN ISO 9001:2000 requirements are fulfilled. 

 

Available services include:

  • Help desk service for a faster access to our support team, to your service order follow up and for general information
  • Planned maintenance, according to your requirement
  • Telephone support from highly-skilled troubleshooting professionals, to isolate and resolve hard- and software problems
  • Web-based remote instrument service for service diagnosis and applications support
  • Customer on-site repair and maintenance service
  • Spare parts availability typically over night or within a few working days worldwide
  • Compliance services for installation qualification, operational qualification / performance verification
  • Site planning and relocation
  • Advise to improve labs efficiency (consumable, method development & how to run the complete solution)